气道上皮相关哮喘基因功能性SNPs的筛选、验证及在哮喘发病机制中的作用

The genome-wide association studies (GWAS) have had remarkable success in discovering susceptibility genes for asthma. Airway epithelium plays an important role in the pathogenesis of asthma due to its direct contact with environmental stimulants. We hypothesis that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the airway epithelial related asthma genes cause altered gene expression that results in abnormal response of the airway epithelium to environmental stimuli， and that abnormal epithelial responses may be an initiating event in asthma. This project will study the functional significance of these SNPs and their roles in the pathogenesis of asthma. First，association study for associated SNPs found in asthma GWAS studies will be replicated in Chinese Han subjects. Then DNA sequencing, combined with the database online, will be used for searching for SNPs with high linkage disequlibrium (LD) with the associated SNP; then bioinformatics software will be used to identify potential functional SNPs. Secondly, following methods will be selected to perform functional studies for potential functional SNPs: target gene-specific protein expression; total mRNA expression；allele-specific quantitative PCR; formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE); electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and fluorescence dual reporter gene assay. Finally, modulation of target genes in airway epithelial cells and its response to allergens and viruses will be studied in the context of functional SNPs. The study will discover new pathways for pathogenesis of asthma, and guide the design of new prevention and treatment interventions.

全基因组关联研究（GWAS）发现哮喘基因取得成功；气道上皮作为直接与环境接触组织，在哮喘发病中起重要作用。我们假设气道上皮相关哮喘基因的单核甘酸多态性（SNPs）可通过改变基因表达水平而改变气道上皮对环境刺激的反应，从而易于发生哮喘。本课题将研究这些SNPs的功能意义及其在哮喘发病机制中的作用。首先，对GWAS发现的气道上皮哮喘基因SNPs在汉族中进行关联研究，并进行测序，结合数据库，搜寻出与关联SNP连锁的SNPs，利用生物信息学软件找出潜在功能性SNPs；然后，选择使用目的基因特异蛋白表达、总mRNA表达、等位基因特异性定量PCR、甲醛参与的调控元件提取方法(FAIRE)、电泳迁移率变动分析（EMSA）及荧光双报告实验验证功能性SNPs；最后，通过过敏源及病毒刺激气道上皮细胞，分析功能性SNPs在哮喘中的病理机制。该研究对发现哮喘相关的新通路、设计新的预防和治疗干预措施具有重要意义。

项目背景：.全基因组关联研究（GWAS）发现哮喘基因取得成功；气道上皮作为人体直接与环境.接触的组织，在哮喘发病和发展过程中起重要作用。我们假设气道上皮相关哮喘基因的单核甘酸多态性（SNPs）可通过改变基因表达水平来改变气道上皮对环境刺激的反应，从而易于发生哮喘。.主要研究内容：.本课题着重于研究这些SNPs 的功能意义及其在哮喘发病机制中的作用。首先对GWAS 发现的气道上皮哮喘基因（共15个基因，108个位点）在汉族人群中进行关联研究。然后利用生物信息学软件筛选出潜在功能性位点。最后通过双荧光素酶报告实验了解SNPs对启动子活性的影响、实时荧光定量PCR方法检测基因多态性对外周血mRNA表达的影响以及利用多因子降维法（MDR）筛选出基因-环境最佳交互作用模型。.研究结果：.在关联研究中共发现14个基因（IL25、IL33、C11orf30、CDHR3、ORMDL3、GSDMB、NFE2L2、TSLP、MYH15、CHI3L1、CXCL14 、PSMD3、IL1RL1和IL18R1）的61个SNPs在患者及对照两组中分布有统计学差异。筛选出肌球蛋白重链15基因（MYH15）rs9288876、rs7635009、rs1454197和壳多糖酶3样蛋白1基因（CHI3L1） rs10399931为潜在功能性位点。通过双荧光素酶报告实验发现上述4个位点通过影响启动子活性参与基因转录调节；实时荧光定量PCR方法发现CHI3L1 rs10399931降低外周血mRNA的表达；MDR分析发现rs10399931和吸烟组成的模型是最佳交互作用模型。本研究发现MYH15和CHI3L1是中国西南地区汉族人群哮喘发生的易感基因。

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