胡黄连苷对大鼠脑缺血损伤的神经保护机制和剂量优化研究

Based on the preliminary studies,the rat models with atherosclerosis and focal cerebral ischemia were established by inserting a thread intraluminally into middle cerebral artery (MCA) from left internal carotid artery (ICA) and divided according to orthogonal experimental design of [L9(34)], and treated by injecting picrosides (Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ) intraperitoneally with different dose at different time. The therapeutic effects and the best therapeutic doses of picrosides on the cerebral ischemic injury were evaluated by neuro-behavioration, regional cerebral blood flow (rCBF), cerebral infarction volume, the concentrations of aquaporin4 (AQP4),neuron specific enolase (NSE), neuroglial mark-protein (S100) and myelin basic protein (MBP) in brain tissues, the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial transmembrane potential (△Ψm),the ultrastructure of blood-brain barrier (BBB), and neural apoptosis. Using immunofluorescent double-stain assay and laser scanning confocal microscopy (LSCM) to detect the co-expression of NSE, glial fibrillary acidic protein (GFAP), ectodermal dysplasia 1 (ED1) and inducible nitri oxide synthase (iNOS), Caspase3, poly ADP-ribose polymerase (PARP), toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear transcription factor κB (NFκB), tumor necrotic factor α (TNFα) in the same neuron, astrocyte, microglia/macrophage, so to confirm their expressing location. Applying real-time quantification polymerase chain reaction (PCR) and Western blot (WB) to determine the expression principle of mRNA and protein of iNOS, Caspase3, PARP, TLR4, NFκB, TNFα. This project aims to explore the signal transduction mechanism of anti-oxidation and anti-inflammation of picrosides, so that to lay a theoretical foundation for researching and developing a new drug for preventing and treating ischemic cerebrovascular diseases.

在原有工作基础上，应用线栓法制备大鼠动脉粥样硬化性局灶性脑缺血模型，根据三因素三水平[L9(34)]正交试验设计原理分组，应用胡黄连总苷(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)干预治疗，通过神经行为学，局部脑血流量，脑梗死体积，脑组织AQP4、NSE、S100和MBP含量，细胞内ROS和线粒体跨膜电(△Ψm)水平，血脑屏障超微结构及神经细胞凋亡等，综合评价胡黄连总苷对缺血性脑损伤的治疗作用和最佳剂量。免疫荧光双重染色和LSCM技术检测NSE、GFAP、ED1与iNOS、Caspase3、PARP、TLR4、NFκB、TNFα在神经元、星型胶质细胞、小胶质/巨噬细胞中的共表达，明确其表达定位；实时定量PCR和Western blot检测iNOS、Caspase3、PARP、TLR4、NFκB、TNFα基因和蛋白表达规律。探索胡黄连总苷抗氧化和抗炎作用的信号转导机制，为研究开发防治缺血性脑血管疾病新药奠定理论基础。

脑血管疾病是危害人类健康的三大疾病之一，目前尚无有效的治疗方法。急性缺血性脑卒中发生后，缺血半影区有一定量幸存且易受损伤的神经细胞，在治疗时间窗内恢复血液供应可使这些神经细胞存活并恢复功能。本课题组前期研究结果表明，中药活性成分胡黄连苷II对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用，但其作用机制和最佳治疗剂量及时间窗尚不十分清楚。本研究应用双侧颈总动脉结扎法和大脑中动脉线栓法建立大鼠脑缺血模型，按照二因素四水平【（L16(45)】正交试验设计原理分组，在不同的缺血时间经腹腔注射不同剂量的胡黄连苷II干预治疗，通过神经行为学、组织病理学和超微结构病理学、原位末端标记和流式细胞术等技术证实，胡黄连苷II能抑制脑缺血损伤引起的神经细胞凋亡，改善神经细胞和血脑屏障的形态结构及动物的神经行为功能。生物化学、免疫组化、酶联免疫吸附、Western Blot和RT-PCR等分子生物学实验表明，胡黄连苷II可降低脑缺血损伤后神经元NSE和S100B表达水平，增强MBP表达水平，对神经细胞、神经胶质细胞和神经纤维髓鞘发挥保护作用；通过下调脑组织AQP4表达水平，降低胶质细胞足突膜的离子通透性而减轻脑水肿程度；通过抑制细胞内MMP9和COX2等炎性因子表达，抑制Raf/MEK/ERK/COX2信号通路，减轻神经细胞及血脑屏障基膜的炎症反应而发挥抗炎作用；通过抑制线粒体CytC释放、降低Caspase-9、Caspase-3、Rock1表达，提高血清和脑细胞内SOD、GSHPx和CAT的活性，降低脂质过氧化物MDA、NO和H2O2等自由基的水平而发挥抗氧化作用。通过下调Nox2、Rac-1表达，调节ROCK-MLCK-MMP2-Claudin5信号通路保护血脑屏障。根据正交试验设计原理综合评价得出，胡黄连苷II治疗脑缺血损伤的最佳时间窗和最佳治疗剂量为脑缺血2h腹腔注射20mg/kg体重。本研究成果主要创新点：在国内首次根据正交试验设计原理，研究了胡黄连苷II对缺血性脑损伤的神经保护作用及其最佳治疗剂量和治疗时间窗，为进一步研发胡黄连制剂奠定了理论基础；通过神经行为学、组织病理学和超微机构病理学、原位末端标记和流式细胞术等技术，证实了胡黄连苷II能抑制脑缺血损伤引起的神经细胞凋亡，改善神经细胞和血脑屏障的形态结构以及大鼠的神经行为功能；通过现代分子生物学技术，证实了胡黄连苷II在脑缺血损伤中的抗

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