克拉酸生物合成过程机制解析与代谢调控研究

Colanic acid is a kind of extracellular polysaccharide, which has wide application prospect in the filed of functional nutrition and health care products. However, the assembly process and regulatory mechanism of the repeat unit of colanic acid are not clear, which obstruct the directed metabolic engineering of colanic acid metabolic networks. In addition, the metabolic networks of colanic acid is complex and the required precursors are all derived from the glycolysis pathway. Therefore, how to dynamic balance the cell growth and the synthesis of colanic acid is also a crucial problem. The dynamic control of metabolic networks is an effective strategy to balance cell growth and product synthesis while the existing methods for constructing dynamic regulatory elements have the defect in complex structure and poor universality. This project intends to utilize molecular biology and enzyme engineering technology to discover the assembly and regulation process of colanic acid repeat units. Then, employing synthetic biology means to construct antisense transcription-based pyruvate sensing devices. Finally, we will apply the sensor components to dynamically balance cells growth and efficient synthesis of colanic acid, and accomplish the dynamic regulation and optimization of the complex metabolic network of colanic acid. This research will enrich the theories and methods of constructing dynamic sensing components and provide a new standpoint for the dynamic regulation and optimization of complex metabolic networks, which has important theoretical and practical value.

克拉酸（Colanic acid）作为一种胞外多糖，在功能营养品及保健品领域具有良好的应用前景。然而克拉酸结构重复单元的组装过程与调控机制尚不清晰，导致难以对克拉酸的代谢网络进行定向的代谢工程改造。此外，克拉酸的代谢网络复杂且所需前体均来自于糖酵解途径，因此如何实现细胞生长和克拉酸高效合成的动态平衡也是一个关键难题。代谢网络的动态调控是平衡细胞生长和产物合成的有效策略，但现有的动态调控元件构建方法具有结构复杂、普适性差的缺点。本项目拟首先利用分子生物学及酶工程技术解析克拉酸重复单元的组装与调控过程，然后利用合成生物学手段构建基于反义转录的丙酮酸感应元器件，最后利用该感应元器件动态平衡细胞生长与克拉酸的高效合成，实现对克拉酸复杂代谢网络的动态调控与优化。研究成果将丰富动态感应元器件构建的理论与方法，为复杂代谢网络的调控优化提供新思路，具有重要理论和实际应用价值。

克拉酸是一种具有独特生理活性的杂多糖。其可以通过调节细胞内的线粒体动力学和未折叠蛋白反应来延缓细胞的衰老和破裂，在化妆品，保健品，医疗和科研领域有重要的潜在应用价值。然而，克拉酸的代谢调控途径复杂、发酵条件严苛、分子量大容易导致发酵液粘稠等问题，限制了其的高效合成。基于此，本项目围绕着响应关键中心代谢物丙酮酸的双功能生物传感器的设计构建、克拉酸代谢网络的全局调控和克拉酸分子量大小优化三个方面开展了研究。.首先，通过突变或改变转录因子PdhR的结合位置，设计了一系列具有不同动态范围的丙酮酸激活型生物传感器。然后，结合实验结果和数学模型，鉴定了反义转录抑制基因表达的作用机制。反义转录进一步作为“NOT”门，将丙酮酸激活信号转换为丙酮酸抑制信号，构建丙酮酸抑制型生物传感器。随后，以E. coli K-12 MG1655为出发菌株，通过解除RCS系统对克拉酸合成的调控作用，使克拉酸的发酵温度由20°C提高到30°C，产量达971 mg/L，较野生型提高了47.55倍。经培养基优化，克拉酸产量提升至6.4 g/L。通过增强克拉酸前体的供应，产量进一步提升至7.5 g/L。最后，纯化了来源于噬菌体NST1的克拉酸水解酶，并使用其水解克拉酸，使克拉酸分子量降低至1148 Da。通过添加4000 U/L的克拉酸水解酶，克拉酸的产量在摇瓶水平提高至17.04 g/L。在3-L生物反应器中，克拉酸的产量达24.99 g/L，是目前已报道的最高生产水平。.综上所述，本项目成功构建了响应丙酮酸的双功能生物传感器，为细胞中心代谢的全局调控提供了新工具与新思路；对克拉酸代谢网络进行了全局调控显著提高了其的产量和发酵温度；获得一种来源于噬菌体NST1的克拉酸水解酶，降低了克拉酸的分子量，并最终显著提升了克拉酸的合成能力，为工业化生产克拉酸奠定了基础。基于上述研究，在国内外权威期刊发表论文16篇;申请国内专利4项，其中授权1项；申请国际专利1项，其中授权1项。获2022年全国商业科技进步奖特等奖。

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