漆黄素对单增李斯特菌致炎通路的调控机制研究

Listeria monocytogenes, listed as the fourth pernicious food-borne bacterium, is an important zoonotic pathogen which causing severe invasive infection in livestock, fowl and human beings and threatening public hygiene safety. Inflammasomes are integral parts of innate immune system and have been proved to play a crucial role in combating bacterial infection and inflammatory responses. In our previous research, it has been shown that fisetin has significant inhibit the pore-forming activity of listeriolysinO (LLO) and has the anti-inflammatory response caused by injecting Listeria monocytogenes. However, it is still not clear that the mechanism of fisetin via regulating inflammasomes against inflammation induced by Listeria monocytogenes and LLO. Based on effector molecules in inflammasomes signaling pathway, by means of modern molecular biology and immunological techniques, in this project, the regulation of inflammatory cytokines and key effector proteins expression will be analyzed in Listeria monocytogenes or LLO caused inflammation which interfered by fisetin in vivo and in vitro, the function of the vital effector molecules will be demonstrated in the process of inflammation induced by Listeria monocytogenes and LLO, the regulatory mechanism of fisetin on inflammatory signaling will be revealed at the molecular level, and the new targets of fisetin against inflammation induced by Listeria monocytogenes and LLO will be found. It may lay the foundation for the further development and utilization of the fisetin as a lead compound and for the new drug targets screening research.

单增李斯特菌是重要的人兽共患病原菌，该菌不仅感染家畜、家禽，还严重威胁人类健康以及公共卫生安全，被列为第四大食源性致病菌。炎症小体是固有免疫系统的组成部分，在对抗微生物感染以及炎症反应中发挥重要作用。本课题组前期研究筛选到漆黄素显著抑制单增李斯特菌溶血素（LLO）成孔活性，并抑制其炎症反应。然而，漆黄素调控炎症小体抗单增李斯特菌及LLO致炎机制尚不明确。本项目拟以炎症小体信号通路相关效应分子为切入点，通过漆黄素干预单增李斯特菌及LLO诱导体内外炎症反应，应用现代分子生物学和免疫学相关技术，分析炎症小体信号通路的关键效应蛋白及炎症细胞因子等表达的变化规律，阐明关键效应蛋白分子在单增李斯特菌及LLO诱导炎症中的作用，从分子水平揭示漆黄素调控炎症小体信号通路的作用机制，明确漆黄素抗单增李斯特菌及LLO致炎作用靶点，为漆黄素作为先导化合物进一步研发及新药靶标的筛选奠定基础。

项目组通过漆黄素作用野生型的单增李斯特菌菌株LM和LLO敲除株△hly感染妊娠小鼠，研究发现对照组小鼠的流产率高达80%，而药物组和△hly阴性对照组没有小鼠流产现象。倍比稀释菌落计数发现漆黄素降低了单增李斯特菌感染妊娠小鼠子宫、胎盘和胎儿的细菌定殖数。胎盘组织切片发现药物组缓解了单增李斯特菌感染妊娠小鼠胎盘的病理性损伤。ELISA和Western blot 研究表明药物组显著降低了单增李斯特菌感染妊娠小鼠胎盘和子宫的炎症细胞因子TNF-α和IL-6的表达，抑制炎症信号通路NF-κB和细胞死亡相关蛋白caspase 3和caspase 9的活化。采用胎盘滋养层细胞BeWo细胞建立体外感染模型，发现漆黄素减少单增李斯特菌感染Bewo细胞caspase 3的活化。药物处理后的胞内细菌数也显著少于阳性组。漆黄素通过抑制LLO的寡聚化作用，从而抑制了细菌胞内和胞间大量繁殖，减弱细菌对胎盘的破坏作用，达到了抑制流产以及胎儿感染的作用。在本项目研究平台上还拓展完成了隐丹参酮、桦木醇等对单增李斯特菌感染的保护作用及分子机制研究。LM和Δhly感染J774巨噬细胞模型中发现，单增李斯特菌感染引起了MAPK信号通路呈现LLO依赖性的强烈激活，而隐丹参酮药物处理抑制了MAPKs的磷酸化，并减少了TNF-α和IL-6促炎因子的分泌，起到显著的抗炎作用。药物组可以显著促进J774巨噬细胞中Nrf2的核转移，并促进受Nrf2/ARE调节的以HO-1为主的一系列抗氧化作用相关基因的表达，在细菌-细胞共感染体系中药物组同样显著激活了Nrf2信号通路。同时，抑制了感染体系中的NLRP3炎性小体的激活和成熟IL-1β的产生。综上所述，包括漆黄素在内的某些天然成份能够抑制单增李斯特菌感染引发的一系列LLO依赖性的细胞损伤和炎症反应，可以作为有潜力的抗感染药物或作为抗生素协同剂进行开发利用。

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