采用三维培养体系模拟体内不同造血微环境阶段诱导人胚胎干细胞向红细胞分化和成熟的实验研究

人胚胎干细胞（Human embryonic stem cells, hESCs）和诱导性多潜能干细胞（Human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）具有分化为多种组织细胞类型的能力，其中向血液细胞，尤其是红细胞的分化近年来受到广泛关注。由于红细胞具有无核和长寿的特征，相对而言具有更高的移植安全性，有望更早进入临床。造血发生本身是是造血干细胞发生、增殖、分化、成熟的过程，其过程本身伴随着造血干细胞与所处微环境之间的相互作用。迄今为止所有较为成功的体外诱导方案都是对体内造血微环境不同程度的模拟，并且都是在二维培养状态下进行的。本课题拟采用三维培养体系结合人源性基质细胞来模拟体内胚胎早期AGM区造血和成体骨髓造血微环境，分阶段诱导hESC向红细胞分化和成熟，为以hESC/hiPSC为资源规模化获取高质量红细胞应用于临床输血奠定基础。

造血发生是造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）发生、增殖、分化、成熟的过程，其过程本身伴随着HSC与所处微环境之间的相互作用。迄今为止所有体外诱导方案都是对体内造血微环境不同程度的模拟，且都是在二维培养状态下进行的。遇到的问题主要包括两个方面：一是HSC的体外扩增困难，在扩增中容易分化，难以从一份供体获得足量的HSC；二是在体外进行HSC诱导分化离开了体内的微环境，效率不高。基于此，本课题采用三维培养体系结合人源性基质细胞来模拟体内胚胎早期AGM区造血和成体骨髓造血微环境，促进HSC的体外扩增和诱导分化与成熟。我们分别以人胚胎AGM区基质细胞株（hAGM-SC）和脐带组织来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)为支持细胞，将其接种于微载体上进行培养，再经丝裂霉素Ｃ处理后与人ＨＳＣ共培养，并与二维培养体系相对照，比较三维培养体系对ＨＳＣ增殖和分化的影响。不仅如此，本研究中还引入StemRegenin 1 (SR1)，作为芳香烃受体激动剂，该小分子化合物据报道可显著促进人HSC 的增殖，且不引起细胞分化。结果显示，无论ＭＳＣ还是ＡＧＭ－ＳＣ都能在微载体上贴附生长。丝裂霉素Ｃ处理也对细胞的生长和功能状态有显著影响，以浓度为10ug/ml丝裂霉素Ｃ处理１－２小时为最佳。普通培养的脐血HSC不增殖，1uM SR1可促使其增殖（4.4倍）。10uM SR1后期对细胞有毒性作用。在共培养体系中，同时加入1uM SR1时，二维培养中的脐血HSC增殖效果（7.6倍）虽强于普通培养，但较三维培养（15.7倍）还有显著差距。培养10天后，流式检测显示，在HSC培养增殖过程中，与刚分选后结果（CD34阳性率98.38%）相比，三种培养方法培养的HSC（SR1 1uM 99.51%、SR1 1Um+AGM-SC+2D 99.7%、SR1 1Um+AGM-SC+3D 99.79%）CD34阳性率均无显著差异。由于HSC在体外很难增殖，因而本结果对HSC体外增殖及向其他功能性细胞诱导分化具有重要意义。本研究首次将ＳＲ１引入到以ＡＧＭ－ＳＣ和脐带ＭＳＣ为支持细胞的三维扩增体系中，并证实该体系有利于ＨＳＣ的体外扩增，提示应用本项目构建的三维培养体系有望更好地模拟ＨＳＣ在体内生存的微环境，为ＨＳＣ的体外扩增和分化研究提供新思路。

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