基于体外展示技术的乳腺癌干细胞靶分子筛选和进化研究

Cancer stem cells is a kind of cells which have strong capability of tumorigenesis.According to the "seeds and soil" theory, cancer stem cells participate in tumorigenesis and metastasis through migrating into circulatory system. So detection of cancer stem cell surface markers may be useful for the early diagnosis of tumor occurence and progression, and the study of stem cells for molecular targets of tumor is of great significance to the treatment of tumors. Ribosome display technology is a powerful method for screening large library and obtaining molecular evolution, with advantages such as simplicity in constructing library, large capacity of library and extensive diversity of molecules. Based on the theory and technology above, this study focuses on cancer stem cells，aims to screen targeting peptide of high affinity to cancer stem cells through improved ribosome display technology, and to clarify the biological characteristics of the peptide in vitro and in vivo.This research is expected to build a high throughput, sensitive and effective screening system for specific molecules of cancer stem cells, and has considerable significance for early diagnosis, prognosis prediction and targeted therapy of malignant tumor.

肿瘤干细胞是一类具有很强肿瘤形成能力的细胞，目前"种子与土壤学说"的理论认为,肿瘤干细胞很可能通过体内循环系统发生迁移,参与肿瘤的发生和远处转移， 因而检测肿瘤干细胞的表面标记有可能实现肿瘤发生与发展的早期诊断，而研究针对肿瘤干细胞的靶分子则对肿瘤的治疗具有重要意义。核糖体展示技术具有建库简单、库容量大、分子多样性强等优点，是一种筛选大型文库和获取分子进化强有力的方法。基于以上理论及技术基础，本研究着眼于肿瘤干细胞，旨在通过改进的核糖体展示技术筛选与肿瘤干细胞具有高度亲和力的靶向性多肽，并进一步明确其体外和体内的生物学特征。研究的开展将有望建立一个高通量、敏感且高效的针对肿瘤干细胞的特异性分子筛选系统，对肿瘤的早期诊断、转移预测及靶向治疗都具有相当重大的意义。

检测肿瘤干细胞的表面标记及靶分子对肿瘤发生发展的早期诊断与治疗具有重要意义，基于核糖体展示技术筛选与肿瘤干细胞具有高度亲和力的靶向性分子研究，将有望建立一个高通量、敏感且高效的针对肿瘤干细胞的特异性分子筛选系统。本研究按计划执行基础上得出干性微球体作为一个整体进行集团性的侵袭转移，表面干性标记的差异性是乳腺癌细胞及临床异质性的重要表现，CD44、EpCAM、ALDH1是乳腺癌干细胞表面分子探究的重要标记，针对表面干性标记的平衡态及微球体间沟通的阻断机制干预是治疗乳腺干细胞治疗的重要途径。构建的自然状态下的抗乳腺癌抗乳腺癌人源性ScFvs文库容量可达10^13以上，文库的稳定性及丰度极大的放大了自然条件下微量抗体基因的容量，是临床上对乳腺癌抗体基因筛选的有效方法。针对乳腺癌干性微球体分选后的标记识别，核糖体展示技术实施筛选的scFv分子获得了体外的达尔文进化，且成功表达出抗肿瘤相关蛋白，且多次筛选的纯化单链抗体蛋白对干细胞表面相关抗原CD44、ALDH1、CA-153均具有高度亲和力。筛选的单链抗体分子可以以核酸适配子的形式对乳腺癌干样细胞进行较好的亲和识别，对正常乳腺细胞的毒性较弱，且联合化疗后可在体内外协同作用下对乳腺癌干样微球体细胞起到明显的抑制增殖、促进凋亡、抑制侵袭转移，其作用与其对干细胞表面标记的亲和识别杀伤、抑制MAPK信号通路、抑制含有BRCT结构域表达蛋白表达、降低干样细胞DNA损伤修复相关蛋白的表达相关。通过蛋白间的相互作用检测，含有BRCT结构域表达蛋白及DNA损伤修复相关蛋白与干细胞标记蛋白正相关，对MAPK信号通路及FA/BRCA信号通路的干预将是我们治疗乳腺癌干细胞的有效靶向方向。研究对天然状态的乳腺癌的抗体分子工程以及对肿瘤的早期诊断、转移预测及靶向治疗都具有相当重大的意义。

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