真核基因定点编辑技术优化和基于高通量基因敲除文库搭建的功能性筛选平台在生物医学研究上的应用

One of the core questions in the field of biomedical research is the effective and massive association of genes’ function and certain biological, developmental or disease-related process. The recent emergence of gene targeting technology in eukaryotes, especially ZFN, TALENs and the CRSIPR/Cas9 systems have enabled researchers across broad-spectrum of fields to study gene and its function in an unprecedented fashion and efficiency. We have been involved in TALE-related technique development, i.e. the fast assembly methodology of TALE arrays and the complete decoding of TALE RVDs for DNA recognition preference (PLoS One, 2013; Cell Research 2014). We have recently generated a CRISPR/Cas9-mediated gene knockout library in human cells, and developed the complete strategy for functional genomics using this powerful platform (Nature 2014). We propose to upgrade the gene targeting technology, especially the development of the whole genome gene knockout library in eukaryotic cells through refined CRISPR/Cas9 system. With the establishment of the collection of sgRNA libraries, we are determined to screen for host targets essential for the toxicity of both TcdA and TcdB of Clostridium difficile, as well as for the host cell surface proteins important for HCV infection, especially for viral entry and cell-to-cell transmission. The broad application of CRISPR/Cas9 library in functional genomics will undoubtedly promote the fast progress of biological and biomedical research studies.

当前医学生物学领域的核心问题之一，是如何高通量、高效率地确定在特定生理、病理等情况下发挥关键作用的基因产物和通路。最近几年基因打靶技术，特别是ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系统等的出现和发展为科研人员研究高等生物的基因功能、生理病理机制提供极大方便。我们前期在TALE相关技术包括重复模块组装及新DNA碱基识别RVD等方面有许多积累，在利用CRISPR/Cas9系统构建基于基因敲除的功能性筛选平台也有突破性进展（Nature 2014）。我们计划对真核基因定点修饰技术进行优化，特别是建立更加高效的全基因组真核基因敲除文库用于高通量功能性筛选。我们将主要利用这一新型强大的正向遗传筛选平台研究艰难梭菌毒素蛋白A及B的宿主细胞靶位点，以及和丙型肝炎病毒入胞以及在细胞间传递途径中起重要作用的宿主蛋白。真核基因敲除特别是高通量功能性筛选的应用，必将极大地推动广泛的生物医学相关领域的发展。

基于CRISPR系统的高通量功能性筛选技术的建立使人们能够迅速定位与特定生物学过程相关的重要基因。但是，目前的高通量功能性筛选仍然存在许多问题，如筛选范围、分辨率、准确度都有局限。针对上述问题，我们在研究工作中建立并优化了一系列基于高通量基因敲除文库的功能性筛选平台和方法学，并利用该平台成功鉴定了多种病原-宿主相互作用的关键基因，主要研究成果包括：1）建立了利用配对gRNA进行大片段删除和靶向剪接位点进行敲除的方法，实现了对长链非编码RNA进行高通量功能性筛选，为系统发现和解析lncRNA功能提供了强大的工具；2）开发了名为PASTMUS的新方法，实现了对目标蛋白进行单氨基酸精度的功能图谱绘制；3）建立了构建CRISPR文库的新方法iBAR，首次实现了在高MOI条件下的高通量功能性筛选，提高了筛选精度和效率；4）首次报道了名为LEAPER的新型RNA单碱基编辑技术，该技术仅需要在细胞中表达向导RNA即可招募细胞内源脱氨酶实现靶向目标RNA的编辑, 为生命科学基础研究和疾病治疗提供了一种全新的工具；5）针对基因编辑工具发展了一系列延展型应用，如利用基因编辑工具进行染色质成像及表观遗传识别等；6）利用CRISPR筛选技术鉴定发现人新生儿受体蛋白FcRn为B族肠道病毒的脱衣壳受体，发现TRIM26为HCV在宿主细胞中复制所需的关键基因，从而为理解病毒入侵机制及相关药物的开发提供了依据；7）利用CRISPR筛选技术发现了艰难梭菌毒素蛋白A及B进入宿主细胞靶位点。综上所述，该项目完成了既定的研究目标和计划，项目实施所产生的研究成果，包括高通量功能性筛选平台的应用等，将有望促进生物医学相关领域的迅速发展。

内容获取失败，请点击重试