Development of proximity-induced fluorogenic reactions for imaging biomolecular interaction through noncanonical amino acid mutagenesis in response to quadruplet codon and recoding signal

开发邻近诱导的荧光反应,通过响应四联体密码子和重新编码信号的非规范氨基酸诱变来成像生物分子相互作用

基本信息

  • 批准号:
    10033286
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 30.67万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2020
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2020-09-10 至 2022-08-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Prior research efforts in bioorthogonal chemistry have mainly focused on chemistry that is suitable for protein labeling, which requires high rate constants to accommodate rapid cellular processes and/or low abundance of target biomolecules. Taking from a different perspective, this proposal explores an intriguing and important application of bioorthogonal chemistry with slow kinetics that are suitable for the study of biomolecular (e.g., protein-protein) interactions. In specific, we seek to develop a class of proximity-induced fluorophore-forming bioconjugation reaction that is based on alkene-tetrazine chemistry. This class of reaction only produces fluorescence signal when the two reactants that are separately grafted on two molecules (e.g., proteins) are localized to a close proximity through specific biomolecular interaction events. The fluorophore-forming mechanism is fundamentally different from previously reported tetrazine-based fluorogenic reactions that rely on the loss of tetrazine as a quenching group to unmask a pre-existing fluorophore. Since the reaction product is the only fluorescence species within the entire reaction system, this fluorophore-forming reaction produces minimal background signal. The application of the proposed reaction to biological studies requires the attachment of bioorthogonal reagents to proteins in live cells, which will be achieved through noncanonical amino acid (ncAA) mutagenesis. While amber suppression is the most popular approach to introduce ncAAs into proteins in live cells, it leads to read-through of endogenous stop codons and interferes with normal cell physiology. In this proposal, we seek to develop a new approach to reduce undesirable suppression of amber stop codons by using quadruplet codon (UAGN; N= A, G, C, U) decoding that is exclusively dependent on synthetic recoding signals imbedded in mRNA. Without nearby recoding signal, endogenous UAGN codons (i.e. regular amber stop codon plus a following nucleotide) are not decoded to a significant extent. This strategy can be applied to any transfectable cell lines, thus has broad impacts on the general field of ncAA mutagenesis for live-cell studies. Overall, the development of proposed chemical biology tools is expected to greatly enhance one’s ability to probe disease-relevant biological processes.
生物正交化学的先前研究工作主要集中在适合蛋白质标记的化学上,这需要高速率常数来适应快速的细胞过程和/或低丰度的目标生物分子。从不同的角度来看,该提案探索了一个有趣且重要的问题。应用适合研究生物分子(例如蛋白质-蛋白质)相互作用的慢动力学生物正交化学具体来说,我们寻求开发一类邻近诱导的荧光团形成。基于烯烃-四嗪化学的生物共轭反应,仅当分别接枝在两个分子(例如蛋白质)上的两种反应物通过特定的生物分子相互作用事件定位到非常接近时才会产生荧光信号。与之前报道的基于四嗪的荧光反应有根本的不同,后者依赖于四嗪作为猝灭基团的损失来揭示预先存在的荧光团。反应产物是整个反应系统中唯一的荧光物质,这种荧光团形成反应产生最小的背景信号。所提出的反应在生物学研究中的应用需要将生物正交试剂附着到活细胞中的蛋白质上,这将通过非规范来实现。虽然琥珀抑制是将 ncAA 引入活细胞蛋白质中最常用的方法,但它会导致内源终止密码子的通读并干扰正常的细胞生理学。根据提案,我们寻求开发一种新方法,通过使用四联体密码子(UAGN;N= A、G、C、U)解码来减少琥珀终止密码子的不良抑制,该方法完全依赖于嵌入 mRNA 中的合成重新编码信号,而无需附近重新编码。信号,内源 UAGN 密码子(即常规琥珀终止密码子加上随后的核苷酸)在很大程度上未被解码。该策略可应用于任何可转染细胞。总体而言,所提出的化学生物学工具的开发预计将大大增强探测疾病相关生物过程的能力。

项目成果

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