A Scalable Neuron-Based High-Throughput Screening Platform for the Discovery of Compounds that Restore Protein Expression Caused by Genetic Haploinsufficiency

一种可扩展的基于神经元的高通量筛选平台，用于发现可恢复由遗传单倍体不足引起的蛋白质表达的化合物

• 批准号: 9370360
• 负责人: GAVIN R RUMBAUGH
• 金额: $ 68.73万
• 依托单位: SCRIPPS FLORIDA
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2017-07-01 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/9370360
• 关键词: Academia; Alleles; Autistic Disorder; Biological; Biological Assay; Brain; Brain Diseases; Budgets; Chemicals; Childhood; Clinical; Development; Disease; Environment; Epilepsy; Evaluation; Fluorescence; Gene Targeting; Genetic; Goals; Hand; Human; Industrialization; Intellectual functioning disability; Knock-in Mouse; Lead; Libraries; Magic; Mind; Miniaturization; Modeling; Molecular; Mus; Nature; Neurons; Online Mendelian Inheritance In Man; Patients; Pharmaceutical Preparations; Phenotype; Plant Roots; Procedures; Process; Proteins; Reporter; Reporting; Reproducibility; Research; Robotics; Series; System; Systems Development; Testing; Therapeutic; Variant; Work; assay development; base; cost effective; design; disease phenotype; drug discovery; experimental study; flexibility; high throughput screening; improved; miniaturize; neuropsychiatric disorder; novel; protein expression; scale up; screening

PROJECT SUMMARY    Drug discovery pipelines for neuropsychiatric disorders are dry. One approach to rejuvenating these pipelines  would  be  to  create  assays  based  on  relevant  disease  phenotypes  in  primary  neurons,  something  that  is  currently  lacking.  However,  a  scalable  assay  development  platform  that  is  based  on  bona  fide  neurons,  remains  cost  effective,  and  that  can  support  industrial  level  HTS  does  not  currently  exist.  Over  the  past  five  years, our collaborative group has created a flexible and scalable primary neuron assay development system  that is compatible with industrial-­level HTS. Here, our goal is to optimize these procedures and workflows  to  determine  the  limit  of  scalability  of  neuron-­based  HTS  phenotypic  assays  so  that  they  can  easily  support very large campaigns of >200K compounds.    A  substantial  proportion  of  childhood  brain  disorders  are  caused  by  single  autosomal  dominant  variants  resulting in genetic haploinsufficiency. The rare genetic brain disorders that arise from these variants offer the  greatest potential for discovery of robust therapeutics because the disease mechanism is often straight forward  (i.e. low protein expression). Therefore, a rationale strategy to improve conditions in these patients would be to  treat  them  with  “magic  bullet”  compounds  that  raise  expression  of  functional  proteins  from  the  remaining  undamaged  allele  (e.g.  “boosting  compounds”).  De  novo  nonsense  variants  that  cause  SYNGAP1  haploinsufficiency  lead  to  a  genetically-­defined  form  of  intellectual  disability  with  autism  and  epilepsy  (MRD5;;  OMIM#603384)  that  may  explain  up  to  1-­2%  of  all  ID  cases.  The  accepted  cause  of  this  disorder  is  low  functional protein expression in neurons caused most often by truncating SYNGAP1 nonsense variants. As a  means to refine the neuron-­based HTS system, and to advance treatment for ASD-­related disorders, we  are  seeking  to  scale-­up  and  implement  an  assay  for  SynGAP  expression  that  is  compatible  with  industrial-­level robotics. In the first Aim, we will optimize an HTS-­compatible and disease-­relevant SynGAP  expression  assay.  This  assay  is  based  on  mouse  primary  neurons  where  tdTomato  fluorescence  reflects  steady-­state  endogenous  SynGAP  protein  levels.  In  the  second  aim,  we  will  miniaturize  the  SynGAP  expression assay to the 1536-­well format. This miniaturization process would enable an HTS-­scale screen of  this,  or  any  other  related  neuron-­based  phenotypic  assay,  of  up  to  400,000  culture  wells  using  a  standard  screening budget. Finally, we will implement the SynGAP expression assay in a true uHTS environment and  then  validate  lead  compounds  that  emerge  from  a  20K  compound  pilot  screen,  including  a  10K  compound  repurposing  screen  of  known  “safe  in  human”  compounds.  The  impact  of  this  project  that  we  expect  to  develop procedures that will increase the scale of HTS campaigns in neurons by 10-­fold or more relative to the  current state-­of-­the-­art in academic screening centers. We also expect to validate at least one lead compound  that boosts SynGAP expression, hopefully from the repurposing library.

项目摘要   神经精神疾病的药物发现管道干燥。 将根据原发性神经元中的相关疾病表型创建测定，这是 但是，目前缺乏。 仍然具有成本效益，并且可以支持目前不存在的工业水平HT。 多年来，我们的知识小组创建了一个灵活且可扩展的主要神经元测定系统 这与工业级别的HT兼容。 确定基于神经元的HTS表型测定的可伸缩性极限，以便它们可以轻松 支持> 200k化合物的大型运动。 儿童脑疾病的很大一部分是由单个常染色体显性型变体引起的 导致遗传性无遗传性。 发现强大的世代毒剂的最大潜力这种疾病机制通常是海峡前进 （即低蛋白质）。 用“魔术子弹”对处理功能蛋白的表达从剩余的 未损坏的等位基因（例如“增强化合物”）。 单倍不足会导致一种遗传定义的智力障碍形式，其自闭症和癫痫病（MRD5 ;;;;;; OMIM＃603384）可以解释所有ID病例的1-2％。 神经元中的功能蛋白表达最常是由syngap1废话方差作为a引起的 用于完善基于神经元的HTS系统的手段，并为与ASD相关的疾病提供建议治疗，我们 正在寻求扩大和实施与syngap表达式相兼容的测定法 工业级机器人技术。 表达测定。 稳态内源性蛋白质水平。 对1536孔格式的表达测定。 使用标准 筛选预算，最后，我们将在真正的UHTS环境中进行表达 然后验证从20K复合试点屏幕中出现的铅化合物，包括10K化合物 已知“安全”化合物的重新筛选。 制定程序将神经元中HTS运动的规模增加10倍或更多相对于 目前的学术筛查中心中的最新面积。 这可以提高Syngap的表达，希望来自重新利用的库。