Metallobiochemistry of Mn/Fe protein cofactors

Mn/Fe 蛋白质辅因子的金属生物化学

• 批准号: 9751905
• 负责人: Hannah S Shafaat
• 金额: $ 38.25万
• 依托单位: OHIO STATE UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2018-09-01 至 2023-08-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/9751905
• 关键词: Active Sites; Aerobic; Binding; Catalysis; Chemicals; Chlamydia; Chlamydia trachomatis; Coupled; Development; Directed Molecular Evolution; Electron Spin Resonance Spectroscopy; Electron Transport; Electrons; Environment; Enzymes; Genus Mycobacterium; Goals; Immune system; Kinetics; Knowledge; Metalloproteins; Metals; Microbe; Modeling; Molecular; Mutagenesis; Mycobacterium tuberculosis; Natural regeneration; Nitrogen; Optics; Organism; Oxidation-Reduction; Oxygen; Pathogenicity; Physiologic pulse; Physiological; Play; Process; Property; Protein Engineering; Proteins; Reaction; Research; Resistance; Role; Site; Techniques; Thermodynamics; Time; Transition Elements; Virulence; Work; chemical property; cofactor; design; electronic structure; geometric structure; oxidation; pathogen; programs; scaffold; targeted treatment

Project Summary/Abstract    This  research  program  will  establish  the  fundamental  chemical  principles  underlying  the  newly  discovered  Mn/Fe  proteins.  The  active  sites  of  these  proteins  defy  conventional  inorganic  wisdom  to  spontaneously  assemble  a  bimetallic  cofactor  that  contains  two  different  transition  metals  in  nearly  identical  coordination  environments.  Following  assembly,  oxygen  is  activated  across  the  metal  centers  to  induce  a  one-­  or  two-­ electron  oxidation  reaction,  with  regeneration  occurring  via  intermolecular  electron  transfer.  Unlike  the  well-­ studied  diiron  enzyme  homologs,  the  molecular-­level  details  of  these  processes  in  Mn/Fe  proteins  remain  unknown.  Because  Mn/Fe-­containing  proteins  have  been  identified  primarily  in  extremophilic  and  pathogenic  organisms,  including  many  species  of  Chlamydia  and  Mycobacteria,  it  has  been  suggested  that  the  heterobimetallic  cofactor  may  offer  resistance  against  reactive  nitrogen  and/or  oxygen  species  generated  by  the host immune system. The proposed studies will probe this hypothesis using the R2lox proteins as a model  scaffold,  examining  reactivity  of  the  Mn/Fe  cofactor  relative  to  a  diiron  site.  Initial  studies  by  the  PI  have  indicated  aerobic  assembly  of  R2lox  proceeds  through  two  distinct  intermediates,  identified  by  time-­resolved  optical  and  EPR  spectroscopy.  The  proposed  work  will  use  an  array  of  spectroscopic  techniques,  including  optical,  resonance  Raman,  CW-­  and  pulsed  EPR,  and  Mössbauer,  to  elucidate  the  electronic  and  geometric  structures  of  these  intermediates.  Targeted  mutagenesis  around  the  active  site  will  allow  identification  of  key  residues  responsible  for  selective  metal  binding,  ultimately  revealing  the  mechanism  by  which  assembly  and  activation  proceed.  To  gain  a  comprehensive  picture  of  the  processes  occurring  at  the  active  site,  the  redox  properties  of  Mn/Fe  cofactors  will  be  characterized  to  determine  the  thermodynamics  and  kinetics  of  electron  transfer, a necessary component for efficient catalysis. Finally, the scope of reactivity of Mn/Fe proteins will be  expanded  using  protein  engineering  techniques.  Rational  metalloprotein  design  will  be  coupled  with  directed  evolution approaches to generate highly active enzymes capable of selective oxidation of targeted substrates.  Collectively,  the  proposed  research  program  will  fill  many  existing  knowledge  gaps  about  the  Mn/Fe  proteins,  better  resolving  the  physiological  role  that  these  unique  cofactors  may  play  in  the  metallobiochemistry  of  microbes.

项目概要/摘要 该研究计划将建立新发现的基本化学原理 这些蛋白质的活性位点违背了传统的无机智慧。 组装一个双金属辅因子，其中包含几乎相同配位的两种不同过渡金属 组装后，氧气在金属中心被激活，引发一或二-反应。 电子氧化反应，通过分子间电子转移发生再生。 研究了二铁酶同系物，Mn/Fe 蛋白中这些过程的分子水平细节仍然存在 未知，因为含 Mn/Fe 的蛋白质主要在极端微生物和致病微生物中被发现。 生物体，包括许多种衣原体和分枝杆菌，有人认为 异双金属辅因子可以提供对活性氮和/或氧物种产生的抵抗力 宿主免疫系统。拟议的研究将使用 R2lox 蛋白作为模型来探讨这一假设。 PI 的初步研究表明，Mn/Fe 辅助因子相对于二铁位点的反应性。 表明 R2lox 的有氧组装通过两个不同的中间体进行，这两个中间体通过时间分辨来识别 拟议的工作将使用一系列光谱技术，包括 光学、共振拉曼、连续波和脉冲 EPR 以及穆斯堡尔，以阐明电子和几何 这些中间体的结构将有助于识别关键的活性位点。 负责选择性金属结合的残基，最终揭示了组装和组装的机制 为了全面了解活性位点发生的氧化还原过程。 Mn/Fe 辅助因子的特性将被表征以确定电子的热力学和动力学 转移，有效催化的必要组成部分。最后，Mn/Fe 蛋白质的反应范围为 使用蛋白质工程技术进行扩展将与定向相结合。 进化方法产生能够选择性氧化目标底物的高活性酶。 总的来说，拟议的研究计划将填补有关 Mn/Fe 蛋白质的许多现有知识空白， 更好地解决这些独特的辅助因子在金属生物化学中可能发挥的生理作用 微生物。