Single molecule imaging of HIV-1 entry
HIV-1 进入的单分子成像
基本信息
- 批准号:8992966
- 负责人:
- 金额:$ 41.26万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:2015
- 资助国家:美国
- 起止时间:2015-08-01 至 2019-07-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:Amino AcidsAntibodiesAntiviral TherapyBindingBinding SitesCD4 AntigensCellsCellular MembraneComparative StudyCytoplasmic TailDyesEnzymesEventExhibitsFluorescence Resonance Energy TransferGoalsGrantHIVHIV Envelope Protein gp120HIV-1ImageImageryIndividualLabelLeadMammalian CellMeasurementMeasuresMediatingMembrane FusionMethodsMolecularMolecular ConformationMonitorPeptidesPositioning AttributeRelative (related person)StructureSurfaceTechnologyTimeTransfer RNAVaccine DesignViralViral ProteinsVirionVirusconformational conversionenv Gene Productsfluorophoreinsightnew technologyphysical propertypublic health relevancereceptorsingle moleculesingle-molecule FRET
项目摘要
DESCRIPTION (provided by applicant): The HIV-1 envelope protein (Env) is a class 1 membrane fusion machine that mediates virus entry into cells. HIV-1 Env consists of a trimer of gp120/gp41 heterodimers. Interaction with the CD4 receptor causes structural rearrangements in gp120, which lead to formation of a coreceptor-binding site. Subsequent interactions with the coreceptor trigger additional Env refolding, with gp41 rearranging into a stable six-helix bundle that is believed to drive fusion between viral and cellular membranes. Recent progress in the structural understanding have provided static images of the pre-fusion conformation of the HIV-1 Env trimer and post-fusion conformation of gp41. However, direct visualization of the conformational transitions, characterization of structural intermediates that lead to membrane fusion have been lacking. To provide insights into the dynamics of the native trimer, we have established single molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) imaging to measure the conformational changes of individual Env molecule in the context of a native trimer on the surface of intact virions. Our studies revealed that the unliganded HIV-1 Env is intrinsically dynamic, transitioning between three distinct prefusion conformations, whose relative occupancies were remodeled by receptor CD4 and antibody binding. Our analysis also directly reveals molecular and temporal events in gp120 that underlie the two-step activation of HIV-1 Env by CD4 and coreceptor through a necessary structural intermediate. Here we propose to concentrate on the next important goal, to directly visualize the conformational events within gp41 that lead to mixing between viral and cellular membranes. Towards this end, we have established suppressor tRNA technologies to introduce unnatural amino acids in mammalian cells. The introduction of a single fluorophore in gp41 in combination with an existing one in gp120 will monitor how CD4 primes gp41 and binding of co-receptor disrupts the association between gp41 and gp120. The insertion of two fluorophores before and after switch regions within HR1 and HR2 regions of gp41 will reveal how individual conformational transitions within the Env trimer lead to fusion peptide exposure and membrane fusion. Because our methods allows insights into the conformational state of native HIV-1 Env trimer on the surface of complete virions, we are also uniquely positioned to evaluate to what extent soluble or precursor constructs currently used to structurally characterize the HIV-1 Env trimer display features of the native Env. An increased understanding of the conformational events underlying HIV-1 Env activation will inform antiviral therapies and vaccine design.
描述(由申请人提供):HIV-1 包膜蛋白(Env)是介导病毒进入细胞的 1 类膜融合机器,由 gp120/gp41 异二聚体三聚体组成,与 CD4 受体相互作用。 gp120 中的结构重排,导致形成辅助受体结合位点,随后与辅助受体的相互作用触发了 gp41 的额外 Env 重折叠。重新排列成稳定的六螺旋束,据信可以驱动病毒和细胞膜之间的融合,结构理解的最新进展提供了 HIV-1 Env 三聚体融合前构象和 gp41 融合后构象的静态图像。然而,构象转变的直接可视化以及导致膜融合的结构中间体的表征一直缺乏。为了深入了解天然三聚体的动力学,我们建立了单分子荧光共振能量转移(smFRET)。我们的研究表明,未配体的 HIV-1 Env 本质上是动态的,在三种不同的融合前构象之间转变,其相对占据被重塑。我们的分析还直接揭示了 gp120 中的分子和时间事件,这些事件是 CD4 和辅助受体通过必要的结构中间体两步激活 HIV-1 Env 的基础。在这里,我们建议集中精力于下一个重要目标,即直接可视化 gp41 内导致病毒和细胞膜之间混合的构象事件,为此,我们建立了抑制 tRNA 技术,以在哺乳动物细胞中引入非天然氨基酸。 gp41 中的单个荧光团与 gp120 中现有的荧光团相结合将监测 CD4 如何引发 gp41 以及辅助受体的结合如何破坏 gp41 和 gp41 之间的关联gp120。在 gp41 的 HR1 和 HR2 区域内的开关区域之前和之后插入两个荧光团将揭示 Env 三聚体内的个体构象转变如何导致融合肽暴露和膜融合。 -1 Env 三聚体位于完整病毒粒子的表面,我们还具有独特的优势来评估目前用于表征 HIV-1 Env 三聚体展示的可溶性或前体构建体的程度天然 Env 的特征。加深对 HIV-1 Env 激活构象基础事件的了解将为抗病毒治疗和疫苗设计提供信息。
项目成果
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