Zebrafish ES cell lines for targeted mutagenesis
用于靶向诱变的斑马鱼 ES 细胞系
基本信息
- 批准号:6684528
- 负责人:
- 金额:$ 32.62万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:2003
- 资助国家:美国
- 起止时间:2003-08-01 至 2006-07-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
DESCRIPTION (provided by applicant): The zebrafish possesses characteristics that make it an ideal model for genetic studies of vertebrate development and human disease. Although large-scale forward mutagenesis screens have been successfully applied to the zebrafish to identify genes that regulate early development, methods are not available for targeted gene inactivation by insertional mutagenesis. The goal of this research is to develop gene-targeting methods using zebrafish embryonic stem (ES) cell lines. To accomplish this goal, the existing zebrafish ES cell culture system will be optimized for use in the production of knockout lines of fish. Conditions will be established that support the optimal growth and survival of germ-line competent ES cells in culture and methods will be developed to improve the efficiency of homologous recombinant colony isolation. To demonstrate the feasibility of this gene targeting approach, the ES cell lines will be utilized to target the inactivation of a gene that is important for normal development, producing a knockout mutant possessing an obvious and well-characterized phenotype. The specific aims of this research are: 1) determine the frequency of germ-line chimera production using late-passage zebrafish ES cell lines; 2) establish clonally-derived ES cell lines that produce germ-line chimeras at a high frequency; 3) derive a feeder cell line from zebrafish spleen that is more effective than the currently used trout spleen cell line at maintaining germ-line competency of the zebrafish ES cells; 4) identify the most efficient method to isolate colonies of homologous recombinants in the ES cell cultures; 5) use ES cell cultures to target the inactivation of the no tail gene to demonstrate the feasibility of this gene-targeting approach. The ES cell-based gene targeting approach developed from this work will complement other genetic methods currently applied to zebrafish and increase the value of this organism as a model for the study of genes important in human development and disease.
描述(由申请人提供):斑马鱼所具有的特性使其成为脊椎动物发育和人类疾病遗传研究的理想模型。尽管大规模正向诱变筛选已成功应用于斑马鱼以鉴定调节早期发育的基因,但尚无通过插入诱变使目标基因失活的方法。这项研究的目标是开发利用斑马鱼胚胎干 (ES) 细胞系的基因靶向方法。为了实现这一目标,现有的斑马鱼 ES 细胞培养系统将进行优化,用于生产鱼类基因敲除系。将建立支持生殖系感受态 ES 细胞在培养物中最佳生长和存活的条件,并将开发方法以提高同源重组集落分离的效率。为了证明这种基因靶向方法的可行性,ES细胞系将用于靶向对正常发育重要的基因的失活,产生具有明显且特征良好的表型的敲除突变体。本研究的具体目的是:1)确定使用晚期传代斑马鱼 ES 细胞系产生种系嵌合体的频率; 2) 建立高频率产生种系嵌合体的克隆衍生 ES 细胞系; 3)从斑马鱼脾脏中获得饲养细胞系,其在维持斑马鱼ES细胞的种系能力方面比目前使用的鳟鱼脾细胞系更有效; 4) 确定在 ES 细胞培养物中分离同源重组体集落的最有效方法; 5)使用ES细胞培养物来靶向无尾基因的失活,以证明这种基因靶向方法的可行性。这项工作开发的基于 ES 细胞的基因靶向方法将补充目前应用于斑马鱼的其他遗传方法,并增加这种生物体作为研究人类发育和疾病中重要基因的模型的价值。
项目成果
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专著数量(0)
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会议论文数量(0)
专利数量(0)
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