ACTIVE SITE DETERMINATION OF THE E-TYPE ATPASES
E 型ATP酶活性位点的测定
基本信息
- 批准号:6628998
- 负责人:
- 金额:$ 26.95万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:2000
- 资助国家:美国
- 起止时间:2000-02-01 至 2005-01-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
The long term goal of the proposed research is to understand the structures and the functions of ecto-ATPases and ecto-apyrases in extracellular nucleotide metabolism in both normal and pathophysiological states. These enzymes, along with the related soluble apyrases, constitute the class of enzymes known as the "E-type ATPases". The E-type ATPases are important for the termination of purinergic receptor-mediated responses, including termination of responses to nucleotides used as neurotransmitters. They are also involved in cell adhesion processes, and are important for maintenance of hemostasis in the cardiovasculature. The cDNAs encoding the three human E-type ATPases will be expressed. Site directed mutagenesis will be performed to identify amino acid residues which are important for ATP and ADP hydrolysis and binding. The site-directed mutagenesis experiments will be designed based on: (1) the newly discovered homologies to the actin/heat shock protein/sugar kinase superfamily of enzymes; (2) careful analysis of amino acid residues that are conserved in all the E-type ATPases; (3) analysis of residues that are different between the ecto-ATPases and ecto-apyrases, yet conserved among the sub-types. Thus, amino acid residues important for nucleotide hydrolysis will be identified, the hypothesis that the E-type ATPases are members of the actin superfamily of proteins will be tested, and the residues important for hydrolysis of ADP in addition to ATP (i.e., residues distinguishing biochemically the ecto-apyrases from ecto-ATPases) will be identified. In addition, in situ nucleotide hybridization and immunolocalization using specific anti-peptide antibodies will be performed to learn which areas of the brain and muscle express which E-type ATPase(s), thereby establishing putative functional roles for the enzymes in extracellular nucleotide metabolism. If site-directed mutagenesis experiments continue to support the hypothesis that the E-type ATPases are members of the actin superfamily of proteins, then three dimensional computer modeling of the mutational results will be done by using the known crystal structures of members of the actin/heat shock protein/sugar kinase superfamily of proteins as templates for small segments of wild-type and mutated E-type ATPase sequences.
该研究的长期目标是了解正常和病理生理状态下细胞外核苷酸代谢中外源ATP酶和外源腺苷三磷酸双磷酸酶的结构和功能。 这些酶与相关的可溶性腺苷三磷酸双磷酸酶一起构成称为“E型ATP酶”的酶类。 E型ATP酶对于终止嘌呤能受体介导的反应很重要,包括终止对用作神经递质的核苷酸的反应。 它们还参与细胞粘附过程,对于维持心血管系统的止血非常重要。编码三种人类 E 型 ATP 酶的 cDNA 将被表达。 将进行定点诱变来鉴定对 ATP 和 ADP 水解和结合重要的氨基酸残基。 定点诱变实验的设计将基于:(1)新发现的与肌动蛋白/热休克蛋白/糖激酶超家族酶的同源性; (2)仔细分析所有E型ATP酶中保守的氨基酸残基; (3)分析外型ATP酶和外型腺苷三磷酸双磷酸酶之间不同但亚型之间保守的残基。 因此,将鉴定对核苷酸水解重要的氨基酸残基,将测试E型ATP酶是蛋白质肌动蛋白超家族成员的假设,并且除了ATP之外,对ADP水解重要的残基(即,区分的残基)生物化学上将鉴定来自外源ATP酶的外源腺苷三磷酸双磷酸酶。 此外,将使用特定的抗肽抗体进行原位核苷酸杂交和免疫定位,以了解大脑和肌肉的哪些区域表达哪种 E 型 ATP 酶,从而确定这些酶在细胞外核苷酸代谢中的假定功能作用。 如果定点诱变实验继续支持 E 型 ATP 酶是肌动蛋白超家族成员的假设,那么将使用肌动蛋白/肌动蛋白成员的已知晶体结构来完成突变结果的三维计算机建模。热休克蛋白/糖激酶超家族蛋白作为野生型和突变 E 型 ATP 酶序列小片段的模板。
项目成果
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