IN VITRO SELECTION OF PROTEINS VIA MRNA-PROTEIN FUSIONS
通过 mRNA-蛋白质融合体外选择蛋白质
基本信息
- 批准号:6032513
- 负责人:
- 金额:$ 20.15万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:2000
- 资助国家:美国
- 起止时间:2000-04-01 至 2005-03-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
The experiments outlined in this proposal are designed to use in vitro selection experiments to explore protein structure, recognition, and catalysis. Because it is not currently possible to design a peptide or protein sequence that is imbued with desired functional properties, we have chosen to pursue an in vitro genetic strategy. We do this by using RNA-protein fusions, peptide or protein molecules covalently attached to the mRNA which encodes them. RNA-protein fusions allow for repeated rounds of selection and amplification of proteins because the coding and polypeptide sequences are united in a single molecule. This technique allows libraries containing more than 1013 different sequences to be generated in the total absence of a living cell. Thus, fusions provide a functional approach to protein design and afford selection where classical genetic screening cannot be applied. Our specific aims are: 1) To improve our understanding and implementation of protein selection using RNA-protein fusions. We have previously implemented RNA- protein fusions as a vehicle for in vitro peptide and protein selection. We propose to i) to examine the mechanism of fusion formation on the ribosome ii) to improve the synthesis and selection of fusion molecules, and iii), to explore protein design hypotheses in the construction of our combinatorial libraries. 2) To develop and explore peptides and proteins that modulate signal transduction pathways. We will use in vitro selection experiments to isolate peptides and proteins that mimic known regulators of G protein function. We will examine the affinity, specificity, and structure of our selected proteins with their target G protein, comparing the size and diversity of the molecules we isolate with the natural regulators. 3) To develop and explore methods to isolate novel catalyts in vitro. We will examine strategies to isolate novel peptide and protein catalysts. The diversity, mechanism, and structure of the sequences isolated will be explored with an eye toward fundamental questions of enzyme architecture. The information that will result from these experiments has tremendous potential to teach us about protein structure, recognition, and catalysis. In addition, our work should enable other laboratories to apply it as a general tool for protein discovery and dissection. The techniques used and specific molecules isolated should greatly facilitate the development of therapeutics for the treatment of human disease.
该提案中概述的实验旨在使用体外选择实验来探索蛋白质结构,识别和催化。 由于目前不可能设计具有所需功能特性的肽或蛋白质序列,因此我们选择追求体外遗传策略。 我们通过使用RNA-蛋白融合,肽或蛋白质分子共同附着于编码它们的mRNA来做到这一点。 RNA-蛋白融合允许重复选择蛋白质的选择和扩增,因为编码和多肽序列是单个分子的结合。该技术允许在没有活细胞的情况下产生包含超过1013个不同序列的文库。 因此,融合为蛋白质设计提供了一种功能性方法,并且在无法应用经典遗传筛查的情况下选择。 我们的具体目的是:1)提高使用RNA-蛋白融合的蛋白质选择的理解和实施。 我们以前已经实施了RNA蛋白融合作为体外肽和蛋白质选择的载体。 我们建议i)检查核糖体II上融合形成的机理,以改善融合分子的合成和选择,以及III),以探索组合库构建中蛋白质设计假设的蛋白质设计假设。 2)开发和探索调节信号转导途径的肽和蛋白质。 我们将使用体外选择实验来分离模仿G蛋白功能的已知调节剂的肽和蛋白质。 我们将研究所选蛋白与靶G蛋白的亲和力,特异性和结构,并将我们分离的分子的大小和多样性与自然调节剂进行比较。 3)开发和探索在体外分离新型催化物的方法。我们将研究分离新肽和蛋白质催化剂的策略。 隔离序列的多样性,机制和结构将介绍酶结构的基本问题。这些实验将产生的信息具有向我们传授蛋白质结构,识别和催化的巨大潜力。 此外,我们的工作应该使其他实验室能够将其作为蛋白质发现和解剖的一般工具。 所使用的技术和分离的特定分子应极大地促进治疗人类疾病的治疗剂。
项目成果
期刊论文数量(0)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(1)
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