低比重リポタンパク質の形状と硬さの同時計測による質の評価

同时测量低密度脂蛋白的形状和硬度进行质量评价

• 批准号: 22K11857
• 负责人: 武田 晴治
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Hokkaido University of Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K11857/
• 关键词: 組み換え受容体; 低比重リポタンパク質; 親和性; バイオレイヤー干渉法; リボタンパク質; 原子間力顕微鏡; 物性; 受容体

市販の血清(健常者)からLDLを、超遠心により分画した. LDLは mLDL(TBARS 約1.5nmol/apoB-100 mg)とoxLDL (TBARS 約12 nmol/apoB-100 mg)を作製した。oxLDLはlag phase後の酸化初期状態のLDLであった。組み換え各受容体のLDLや変性LDLへの親和性については情報が少ないため、組み換えLDL受容体(ReLDL)、組み換えCD36(ReCD36)、組み換えLOX-1受容体(ReLOX-1)の、mLDLまたはoxLDLへの結合能を、Biolayer Interferometry法により解析した.その結果、reLDL受容体の場合、mLDLに対する結合量はoxLDLに対する結合量に対して3.5倍程度増加した。また、oxLDLに対しても結合を示した。reCD36はmLDLにはほとんど結合せず、oxLDLに対しては結合を示した。reLOX-1に関しては、結合量はoxLDL>mLDLであったが、それらの吸着量は、reLDL、reCD36と比較すると3分の一程度であった。そこで、Hisタグを強く結合するTRIS-NTAを用いてBLIセンサーによりreLOX-1を固定化した。その結果、reLOX-1およびoxLDLの吸着量を4倍程度増加させることができ、また、洗浄による解離も改善した。次に各組み換え受容体のLDL認識の重なりを検討した。各組み換え受容体を固定化した樹脂を作製し、mLDLまたはoxLDLを樹脂に添加してインキュベートさせた。その溶液を、金基板上に組み換え受容体を固定化した基板に添加して、洗浄後、固定化されたLDLの数をAFMによりカウントした。その結果、reLDLは一部のoxLDLを結合する可能性があること、reCD36とreLOX-1では認識するoxLDLに差がある可能性があることが示唆された。

通过超速离心从市售血清（健康受试者）中分离出 LDL，将 LDL 制备成 mLDL（TBARS 约 1.5 nmol/apoB-100 mg）和 oxLDL（TBARS 约 12 nmol/apoB-100 mg）。 oxLDL是滞后期后处于初始氧化状态的LDL。由于关于每种重组受体对LDL或修饰LDL的亲和力的信息很少，重组LDL受体（ReLDL）、重组CD36（ReCD36）、重组LOX-1受体（ReLOX-1）、mLDL或oxLDL与oxLDL的结合能力使用生物层干涉法进行分析的结果是，在reLDL受体的情况下，与oxLDL的结合量相比，与mLDL的结合量增加了约3.5倍。它还显示出与 oxLDL 的结合。 reCD36 几乎不与 mLDL 结合，但与 oxLDL 结合。关于reLOX-1，结合量为oxLDL>mLDL，但与reLDL和reCD36相比，吸附量约为三分之一。因此，使用 BLI 传感器使用 TRIS-NTA 固定 reLOX-1，TRIS-NTA 与 His 标签牢固结合。结果，我们能够将reLOX-1和oxLDL的吸附量增加约4倍，并且通过洗涤也改善了它们的解离。接下来，我们检查了每个重组受体识别 LDL 的重叠情况。制备固定有各重组受体的树脂，并将mLDL或oxLDL添加到树脂中并温育。将该溶液添加到固定有重组受体的金基板上，洗涤后，通过AFM对固定化的LDL的数量进行计数。结果表明，reLDL可能结合一些oxLDL，并且reCD36和reLOX-1识别的oxLDL可能存在差异。

项目成果

Binding properties of LDL to recombinant receptors were investigated by biolayer interfere layer method

采用生物层干扰层法研究LDL与重组受体的结合特性

• 发表时间: 2022
• 作者: Seiji Takeda; Sato Nozomu; Ao Hamamuki; Kanako Ushirogata; Taichi Takasuka
• 通讯作者: Taichi Takasuka

バイオレイヤー干渉法(BLI法)と原子間力顕微鏡(AFM)を用いたLDL関連受容体とLDLの相互作用の検討

使用生物层干涉测量 (BLI) 和原子力显微镜 (AFM) 检查 LDL 相关受体和 LDL 之间的相互作用

• 发表时间: 2023
• 作者: 武田晴治;三上宏騎;佐藤 希;後潟夏菜子;高須賀太一
• 通讯作者: 高須賀太一