Evolutionary engineering of sesquiterpene synthases from basidiomycetous fungi

担子菌倍半萜合酶的进化工程

基本信息

批准号：
22K19212
负责人：
一瀬博文
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19212/
关键词：
セスキテルペン合成酵素担子菌

项目摘要

本研究では、「生物は不都合な酵素活性を封印しながら進化した」という独自の仮説に基づき、「封印された酵素が逆進化すればユニークな機能を発現する」ことを実証してモノ創りバイオ技術に新しいコンセプトを提案する。具体的には、木材腐朽担子菌（キノコ）に由来するセスキテルペン合成酵素（STS）をひとつの実験例として、(i) ゲノムから転写されない、(ii) 転写されても正しく翻訳されない、(iii) 翻訳されても酵素活性を示さないSTS群を遺伝子工学的に改変して酵素機能の人為的発現を目指す。本年度は、担子菌Postia placentaおよびPhanerochaete chrysosporiumに由来する「ゲノムから転写されない休眠遺伝子」を標的とした酵素活性の復元を試みた。これまでに転写が確認されていないSTSのゲノムDNA配列を調製し、イントロン領域を人為的に除去して得たcDNAや、糸状菌Aspergillus nidulansに形質転換して得られたcDNAを用い、これらのSTSを酵母に異種発現させて酵素活性を追跡した。一連の研究から、P. chrysosporiumに由来する1種のSTSにおいてセスキテルペン骨格分子を産生させることに成功し、dauca-4(11),8-dieneの産生を可能とした。同化合物を与えるSTSは知られているものの、dauca-4(11),8-dieneおよびその誘導体の生物活性に関しては不明な点が多く、本研究で獲得した遺伝子およびその産物を利用した有用物質合成に興味がもたれる。一方、P. placenta STSの酵素活性復元には至っておらず、STS異種発現に利用する宿主微生物に変更を加えるなどの改良を施して目標達成を目指す。

在这项研究中，基于“生物体在封闭不方便的酶活性的同时进化”的独特假设，我们证明了“如果封闭的酶反向进化，它将表现出独特的功能”，提出了新的技术概念。具体来说，我们使用源自木材腐烂担子菌（蘑菇）的倍半萜合酶（STS）作为实验示例，发现（i）它不是从基因组转录的，（ii）即使它是从基因组中转录出来的，它也不能正确翻译。 (iii) ) 我们的目标是通过基因修饰即使在翻译后也不表现出酶活性的 STS 基团来人工表达酶功能。今年，我们尝试恢复针对源自担子菌 Postia placenta 和 Phanerochaete chrysosporium 的“不从基因组转录的休眠基因”的酶活性。我们制备了迄今为止尚未证实其转录的STS基因组DNA序列，并使用人工去除内含子区域获得的cDNA或通过转化丝状真菌构巢曲霉获得的cDNA在酵母中异源表达，并测定酶活性。被监控。通过一系列的研究，我们成功地在一种源自P. chrysosporium的STS中产生了倍半萜骨架分子，从而能够生产dauca-4(11),8-diene。尽管给出相同化合物的STS是已知的，但关于dauca-4(11),8-二烯及其衍生物的生物活性以及使用该基因及其在本研究中获得的产物的有用物质仍有许多未知之处。合成。另一方面，我们还无法恢复P. placenta STS的酶活性，我们的目标是通过改变用于异源表达STS的宿主微生物等改进来实现这一目标。