Creation of trait diversity through gene dosage effects in allopolyploid wheat

通过异源多倍体小麦基因剂量效应创造性状多样性

• 批准号: 22KJ1943
• 负责人: 古村 翔也
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1943/
• 关键词: コムギ; ゲノム編集; 花成

2022年度はゲノム編集により、開花時期に関する３つの遺伝子をノックアウトした系統を得ることを目的にした。標的遺伝子について、同祖遺伝子を全て含め特異的に認識する gRNA を WheatCripsr (Cram et al. 2019) を用いて１遺伝子につき２つ作製し、Hahn et al. (2019) の tRNA-gRNA 同時発現系により、計６つの gRNA を同時に発現するゲノム編集用ベクターを構築した。ゲノム編集の可否を判断するため、作製したベクターをアグロバクテリウム法により四倍体コムギ品種 "Kronos" へ導入し、その選抜カルスから DNA を抽出した結果、標的遺伝子の１つである PHYTOCLOCK1(PCL1) でゲノム編集が確認された。そして、カルスから計 61 の再分化個体（ T0 植物）を得た。しかしながら、標的遺伝子がゲノム編集された再分化個体は検出されなかった。そこで、Cas9 遺伝子を Hahn et al. (2019) による切断効率のより高い Cas9 遺伝子へと変更した。加えて、複数の gRNA 設計サイトを併用して１遺伝子につき６つの gRNA を設計した。また、Abe et al. (2019) による　Qsd1 の gRNA を用いることで、四倍体コムギにおいて tRNA-gRNA システムにより複数の gRNA を同時に発現できることを確認した。変更後 Cas9 遺伝子ならびに再設計した６つの gRNA を導入した "Kronos" の選抜カルスでは、実施当初に比較して高頻度で目的遺伝子のゲノム編集が確認できた。

2022年，目标是利用基因组编辑获得一个品系，其中三个与开花时间相关的基因被敲除。对于目标基因，我们使用 WheatCripsr (Cram et al. 2019)为每个基因创建了两个特异性识别所有同源基因的 gRNA，并使用 Hahn et al. (2019) 的 tRNA-gRNA 共表达系统构建了基因组编辑。同时表达总共 6 个 gRNA 的载体。为了确定基因组编辑是否可行，我们使用农杆菌方法将制备的载体导入四倍体小麦品种“Kronos”中，并从选定的愈伤组织中提取DNA，结果得到了目标基因之一PHYTOCLOCK1（PCL1）。基因组编辑得到证实。从愈伤组织中总共获得61个再生个体（T0植株）。然而，没有检测到目标基因经过基因组编辑的再分化个体。因此，我们根据Hahn et al (2019)将Cas9基因改为切割效率更高的Cas9基因。此外，我们使用多个 gRNA 设计位点为每个基因设计了 6 个 gRNA。此外，通过使用 Abe 等人 (2019) 的 Qsd1 gRNA，我们证实使用 tRNA-gRNA 系统可以在四倍体小麦中同时表达多个 gRNA。在引入了修饰的Cas9基因和六个重新设计的gRNA的选定的“Kronos”愈伤组织中，与实施初始阶段相比，以更高的频率确认了目标基因的基因组编辑。