植物のオルガネラ特異的ステロール輸送マシナリーの解析

植物中细胞器特异性甾醇运输机制的分析

基本信息

批准号：
22KJ2831
负责人：
小林啓子
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Japan Women's University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2831/
关键词：
花粉葯タペータムステロールイソプレノイドポーレンコート

项目摘要

本研究課題では、ERで作られるはずのステロールエステルがプラスチド由来のエライオプラストに蓄積するタペータム細胞に着目し、以下の２項目の実験により植物のオルガネラ間ステロール輸送機構の調査を計画している。１、エライオプラストへの輸送が起こるステップの推測これまでにステロール生合成などが異常となる変異体の葯を化学固定し、花粉の成熟過程でエライオプラストを含む脂質オルガネラの形態変化の違いを透過電子顕微鏡観察で見出してきている。化学固定は脂質の可視化に適している一方で、試料調整の過程でオルガネラの形の歪みなどの異常が生じる可能性がある。そこで、今年度は引き続き化学固定した葯の観察を進めるとともに、より生体内の状態に近いオルガネラ構造を観察出来るとされる、凍結固定を用いた観察も試みた。その結果、この固定法でも一部の変異体で脂質オルガネラの構造観察に成功した。化学固定では、良好な固定像を得ることが難しかった原色素体からエライオプラストの分化過程で、固定剤などの工夫によりERとの密接な接触が観察されてきている。凍結固定の結果と比較することで、エライオプラストの形成過程でERからどのように物質の輸送が行われるのか、明らかに出来るのではないかと期待している。２、ステロール生合成酵素が局在するオルガネラの特定タペータム生細胞で、ステロール生合成酵素がどのオルガネラに存在するのか調べるために、タペータム組織特異的に発現を誘導したステロール生合成酵素融合GFPなどを植物体に導入するためのベクター構築を行っている。今年度は、主なステロール生合成酵素の一つであるシクロアルテノール合成酵素mRNAの５‘末端配列を調べて、考えられうる最長の予測アミノ酸配列と開始コドンの位置を決定した。得られた情報を元にベクターを構築しており、シロイヌナズナに導入してGFP蛍光の細胞内局在を調べる予定である。

在这个研究项目中，我们将重点关注绒毡层细胞，其中内质网产生的甾醇酯在质体衍生的质体中积累，并计划通过以下两个实验研究植物中的细胞器间甾醇转运机制。 1. 运输到油质体发生步骤的估计我们之前已经对甾醇生物合成等异常的突变体的花药进行了化学固定，并观察了花粉成熟过程中脂质细胞器（包括油质体）形态变化的差异。已通过透射电子显微镜发现。虽然化学固定适用于脂质可视化，但样品制备过程可能会引入异常现象，例如细胞器形状扭曲。因此，今年，除了继续观察化学固定花药之外，我们还尝试了使用冷冻固定法进行观察，据说可以观察到更接近体内的细胞器结构。结果，我们能够使用这种固定方法成功观察一些突变体中的脂质细胞器的结构。在油质体与原生质体的分化过程中，化学固定很难获得良好的固定图像，通过使用固定剂和其他设备观察到与内质网的紧密接触。通过将结果与冷冻固定结果进行比较，我们希望能够阐明在油质体形成过程中物质是如何从内质网运输的。 2.甾醇生物合成酶定位于其中的细胞器的鉴定为了研究活体绒毡层细胞中存在哪些细胞器甾醇生物合成酶，我们使用了在绒毡层组织中特异性诱导表达的甾醇生物合成酶融合GFP等。我们正在构建用于引入植物的载体。今年，我们研究了主要甾醇生物合成酶之一环木菠萝烯醇合酶 mRNA 的 5' 端序列，并确定了最长的预测氨基酸序列和起始密码子的位置。我们根据获得的信息构建了载体，并计划将其引入拟南芥中以研究GFP荧光的细胞内定位。