ヌクレオソームコア粒子とMeCP2、SUV39H1三者複合体の構造解析

核小体核心颗粒、MeCP2和SUV39H1三元复合物的结构分析

• 批准号: 22KJ2566
• 负责人: 牛島 弘嗣
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2566/
• 关键词: エピゲノム; ヌクレオソーム; MeCP2; ヒストンメチル化; 構造生物学; クライオ電子顕微鏡; ヘテロクロマチン

MeCP2とH3K27me3修飾ヌクレオソームのクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を行った結果、MeCP2の密度マップが得られず、MeCP2のどの領域が結合に関与しているのかが分からなかった。そのため、クライオ電子顕微鏡以外の方法で結合領域を特定することを試みた。MeCP2とH3K27me3修飾ヌクレオソームの結合領域を明らかにするため、クロスリンク質量分析を行った。解析の結果、3箇所に架橋が検出された。そのうち、2箇所に関して、MeCP2の180番目のリジンがH2A、H2Bの距離的に離れた領域と架橋していることがわかった。このことから、MeCP2はフレキシブルにヌクレオソームと結合している可能性が示唆された。今後はより多くの架橋を検出するため、架橋条件やサンプル調製条件、測定条件などを検討していく。クライオ電子顕微鏡による観察の結果、MeCP2-H3K27me3修飾ヌクレオソームは特徴的な構造を取っていることが明らかになった。また、構造のバラエティも豊富であり、MeCP2の構造の柔軟性がこのことに影響を及ぼしている可能性が考えられる。この複合体構造が、溶液中でも形成されるのか、今後マスフォトメトリーなど別の手法を用いて証明する予定である。また、MeCP2のどの領域がこの複合体形成に重要であるかを調べるため、現在H3K27me3修飾ヌクレオソーム結合に重要だとわかっているMeCP2のC末端領域を５０アミノ酸残基ずつ欠損させた変異体を作製、調製した。この変異体MeCP2をH3K27me3修飾ヌクレオソームと混合し、クライオ電子顕微鏡で観察することで、MeCP2のどの領域が複合体形成に重要なのかを調べる予定である。

使用冷冻电子显微镜对MeCP2和H3K27me3修饰的核小体进行单颗粒分析，结果无法获得MeCP2的密度图，并且不清楚MeCP2的哪个区域参与结合。因此，我们尝试使用冷冻电子显微镜以外的方法来识别键合区域。为了阐明 MeCP2 和 H3K27me3 修饰核小体的结合区域，我们进行了交联质谱分析。分析结果是，在三个位置检测到交联。在其中两个位点，MeCP2 的赖氨酸 180 被发现与 H2A 和 H2B 的远处区域交联。这表明 MeCP2 可能灵活地结合到核小体上。今后，我们将研究交联条件、样品制备条件、测量条件等，以检测更多的交联。使用冷冻电子显微镜观察表明，MeCP2-H3K27me3 修饰的核小体具有特征结构。此外，结构多种多样，据认为MeCP2的结构灵活性可能对此产生影响。未来，我们计划使用质量光度测定等其他技术来证明这种复杂结构是否可以在溶液中形成。此外，为了研究 MeCP2 的哪个区域对于这种复合物的形成很重要，我们创建了一个突变体，其中从 MeCP2 的 C 端区域删除了 50 个氨基酸残基，目前已知该区域对于 H3K27me3 修饰的核小体结合很重要，准备好了。通过将这种突变体 MeCP2 与 H3K27me3 修饰的核小体混合并用冷冻电子显微镜观察，我们计划研究 MeCP2 的哪些区域对于复合物的形成很重要。

项目成果

メチル化DNA結合タンパク質MeCP2のH3K27me3ヌクレオソーム結合部位の同定

甲基化 DNA 结合蛋白 MeCP2 的 H3K27me3 核小体结合位点的鉴定

• 发表时间: 2022
• 作者: 牛島弘嗣;小沼剛;明石知子
• 通讯作者: 明石知子