頭頸部扁平上皮癌の神経周囲浸潤：ゲノム編集を用いた腫瘍生物学的解析

头颈鳞状细胞癌的神经周围浸润：使用基因组编辑进行肿瘤生物学分析

基本信息

批准号：
22K09934
负责人：
倉田俊一
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kanagawa Dental College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09934/
关键词：
頭頸部扁平上皮癌 p63 浸潤神経神経周囲浸潤 TP63

项目摘要

令和４年度(2022年度)は頭頸部扁平上皮癌由来細胞株からゲノム編集によって作ったp63ノックアウト細胞に関して、遺伝子発現の解析を行うとともに、マトリゲルフィルターによる神経周囲浸潤(PNI)のアッセイ系の構築に向けて実験を進めた。成果を以下に要約する。(1) ゲノム編集細胞としてはすでに中咽頭扁平上皮癌由来FaDu細胞株からCRISPR-Cas9法で構築したTP63遺伝子のノックアウト細胞株で、TP63発現全体が停止することが確認されたので、本研究でPNI活性を親細胞と比較する実験に用いることとした。(2) 遺伝子発現のマイクロアレイ解析を行ったところ、ノックアウト細胞は上皮間葉転換（EMT）を示す明確な変化を示した。加えて NEFL, NCAM1、NRCAM、NEUROD2、SEMA3D/4G/5Bほか神経発生と関連する遺伝子発現の大幅な上昇が検出された。その一部についてRT-qPCRとウエスタンブロットで確認を進めた。(3) 神経周辺浸潤（PNI）活性のアッセイ系を構築するために、まず一般的な浸潤アッセイとしてMatrigelチャンバーを用いて、血清を誘因剤として下層に移動する細胞を測定した。浸潤効率はノックアウト細胞で親細胞の2倍に上昇していた。癌組織は不均一な細胞集団であるが、TP63発現が低下してEMTを示す細胞は集団的な浸潤を先導することが最近報告され、その観察と一致している。さらに誘因細胞としてシュワン細胞に由来する細胞株を用いる浸潤アッセイの条件を検討した。

2022年，我们将分析头颈鳞状细胞癌来源的细胞系中通过基因组编辑创建的p63敲除细胞的基因表达，并使用Matrigel过滤器构建神经周围侵袭（PNI）检测系统并为此进行实验。结果总结如下。 (1) 作为基因组编辑细胞系，已经证实在口咽鳞状细胞癌来源的 FaDu 细胞系中使用 CRISPR-Cas9 方法构建的 TP63 基因敲除细胞系中，整个 TP63 表达被停止。决定在实验中使用它来比较 PNI 活性与亲代细胞的活性。 (2)基因表达微阵列分析显示，敲除细胞表现出明显的上皮间质转化(EMT)变化。此外，还检测到与神经发生相关的基因的表达显着增加，包括NEFL、NCAM1、NRCAM、NEUROD2、SEMA3D/4G/5B。我们继续使用 RT-qPCR 和蛋白质印迹法确认其中一些。 (3)为了构建神经周围侵袭(PNI)活性的测定系统，我们首先使用Matrigel室作为一般侵袭测定，使用血清作为诱导剂测量迁移到下层的细胞。敲除细胞的侵袭效率是亲代细胞的两倍。这一观察结果与最近的一份报告一致，即癌症组织是异质细胞群，但 TP63 表达降低并表现出 EMT 的细胞导致集体侵袭。此外，我们研究了使用雪旺细胞衍生的细胞系作为触发细胞进行侵袭测定的条件。