尿失禁に対する新規再生医療の開発へ向けた外尿道括約筋幹細胞セクレトームの機能解析

尿道外括约肌干细胞分泌组的功能分析，以开发治疗尿失禁的新型再生医学

基本信息

批准号：
22K09451
负责人：
秦聡孝
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Oita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

外尿道括約筋は膜様部尿道を取り囲む横紋筋で、尿禁制に寄与している。しかし加齢に伴い外尿道括約筋細胞は減少しており、筋細胞は脂肪細胞や線維組織に置換されて括約筋機能が低下し、これが高齢者の尿失禁の一因と考えられている。本研究では尿失禁に対する新規再生医療の開発に向けて、ヒト外尿道括約筋幹細胞の培養上清である「セクレトーム」を用いたrational確立に向けて様々な実験を行う。今年度は当教室で樹立した長寿化外尿括約筋細胞を用いて幹細胞から分泌されるセクレトーム解析のための上清回収・濃縮・バイオプレックスの実験を行う予定であった。しかし大学の改修工事に伴う実験の制約などによりセクレトーム解析を行う事が出来なかったため、今年度は新たな（女性の括約筋の分離を目指して）外尿道括約筋幹細胞の分離と長寿化細胞の樹立を行った。また、セクレトームが膀胱平滑筋細胞や線維芽細胞の増殖や細胞外マトリックスに与える影響を細胞培養系にて解析するために、初代培養のヒト膀胱平滑筋細胞及び線維芽細胞の分離培養を行った。インフォームドコンセントの得られた膀胱全摘症例より、手術時に外尿道括約筋組織外尿道括約筋の微量組織を細切し、コラゲナーゼ処理後に初代培養を行った。分離培養した外尿道括約筋幹細胞にCSII-CMV-TERTを遺伝子導入した。さらに横紋筋幹細胞マーカーであるCD56（NCAM）に対する蛍光抗体を用いてフローサイトメーターによって横紋筋幹細胞を分離し長寿化細胞株を樹立した。これまでに8例の外尿道括約筋組織の初代培養を行っており、4例に長寿化遺伝子を導入して3例の長寿化細胞株を樹立した。これらの細胞株については分化・増殖実験を行い横紋筋に分化することを確認した。同時に膀胱平滑筋細胞、線維芽細胞についても初代培養を行い同様に分離を行った。

尿道外括约肌是包围尿道膜的横纹肌，有助于尿失禁。然而，随着年龄的增长，尿道外括约肌细胞数量减少，肌肉细胞被脂肪细胞和纤维组织取代，导致括约肌功能下降，这被认为是导致老年人尿失禁的一个因素。在本研究中，我们将利用人尿道外括约肌干细胞的培养上清液“分泌组”进行各种实验来建立合理性，以开发一种治疗尿失禁的新型再生药物。今年，我们计划利用我们科室建立的长寿命尿道外括约肌细胞，进行上清液收集、浓缩和生物复合分析干细胞分泌的分泌组分析的实验。然而，由于大学翻修的实验限制，我们无法进行分泌蛋白组分析，因此今年我们将开始一个新项目（目的是分离女性括约肌），分离尿道外括约肌干细胞并建立长寿命细胞去了。此外，为了分析分泌蛋白组对细胞培养体系中膀胱平滑肌细胞和成纤维细胞增殖和细胞外基质的影响，我们分离培养了原代培养的人膀胱平滑肌细胞和成纤维细胞。尿道外括约肌组织膀胱全切除术患者术中取少量尿道外括约肌组织切成小片，并获得知情同意，用胶原酶处理后进行原代培养。将CSII-CMV-TERT转染到分离培养的尿道外括约肌干细胞中。此外，使用流式细胞仪使用横纹肌干细胞标记物CD56荧光抗体（NCAM）分离横纹肌干细胞，并建立了长寿命细胞系。迄今为止，我们已对8例尿道外括约肌组织进行了原代培养，并通过向4例中导入长寿基因建立了3个长寿细胞系。我们对这些细胞系进行了分化和增殖实验，并证实它们分化为横纹肌。同时，也以同样的方式对膀胱平滑肌细胞和成纤维细胞进行原代培养和分离。