TTC7A欠損に起因する難治性腸閉鎖症のパラログ遺伝子発現促進による治療

通过促进旁系同源基因表达治疗 TTC7A 缺陷引起的难治性肠闭锁

• 批准号: 22K08725
• 负责人: 金井 理紗
• 金额: $ 2.33万
• 依托单位: Japanese Red Cross Wakayama Medical Center
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08725/
• 关键词: 炎症性腸疾患; 腸閉鎖; 小児; TTC7A; TTC7B; SW620; LoVo; リン脂質

1.ヒト細胞を用いたTTC7A/TTC7Bダブルノックアウトa. HeLa 細胞：TTC7AとTTC7Bのダブルノックアウト株が生存可能かを検討するため、野生型HeLa細胞とTTC7A欠損HeLa細胞に対して、CRISPR/Cas9によるTTC7Bの遺伝子破壊を行なった。HeLa細胞はTTC7Bのアレルを3本持つが、実験の結果、野生型HeLa細胞は3アレルとも変異が起きた細胞を採取できた（TTC7Bのノックアウトは可能であった）が、TTC7A欠損HeLa細胞は1または2アレルの変異細胞は得られたものの、3アレルとも変異した細胞は採取できなかった。よって研究計画当初の予想通り、HeLa細胞ではTTC7AとTTC7Bのダブルノックアウトは不可能で、どちらかが生存に必須である可能性（合成致死の可能性）が高まった。b.ヒト腸管上皮細胞株：HeLa細胞では生存必須性が示唆されたため、腸管上皮細胞株においてもそれが成立するかを検証することとした。ヒト腸管上皮細胞株（LoVo, SW620）に対してCRISPR/Cas9によるTTC7Aの遺伝子破壊を行い、TTC7A欠損細胞株の作成を試みた。LoVo, SW620ともにTTC7Aのアレルを2本持つが、実験の結果、LoVoはSW620と比較して細胞増殖が遅い傾向にあり、LoVoでは片アレルのノックアウトは可能であったものの両アレルのノックアウトは不可能であり、TTC7Aのノックアウト不可能と判断した。SW620においては両アレルのノックアウトが可能であり、TTC7A欠損SW620細胞株が2つ作成できた。

1. 使用人类细胞进行 TTC7A/TTC7B 双敲除：为了检查 TTC7A 和 TTC7B 双敲除菌株是否可行，我们使用 CRISPR/Cas9 测试了野生型 HeLa 细胞和 TTC7A 缺陷型 HeLa 细胞。 TTC7B 的。 HeLa细胞具有TTC7B的三个等位基因，实验结果显示，野生型HeLa细胞能够收集到所有三个等位基因均发生突变的细胞（有可能敲除TTC7B），但TTC7A缺陷的HeLa细胞虽然是突变细胞获得了具有一或两个等位基因的细胞，无法收集所有三个等位基因均发生突变的细胞。因此，正如研究项目开始时所预期的那样，在HeLa细胞中双敲除TTC7A和TTC7B是不可能的，这增加了其中之一对于生存至关重要的可能性（合成致死的可能性）。 b. 人肠上皮细胞系：由于生存被认为对于 HeLa 细胞至关重要，因此我们决定验证这是否也适用于肠上皮细胞系。我们尝试通过使用 CRISPR/Cas9 在人肠上皮细胞系 (LoVo, SW620) 中破坏 TTC7A 基因来创建 TTC7A 缺陷细胞系。 LoVo和SW620都具有TTC7A的两个等位基因，但实验结果显示，LoVo的细胞增殖往往比SW620慢，虽然可以敲除LoVo中的一个等位基因，但不可能敲除两个等位基因确定TTC7A的敲除是可能的。在 SW620 中可以敲除两个等位基因，并创建了两个 TTC7A 缺陷型 SW620 细胞系。