カルシウム恒常性障害に着目した先天性大脳白質形成不全症の新規細胞病態の解明

阐明先天性脑白质增生症的新型细胞病理学，重点关注钙稳态紊乱

基本信息

批准号：
22K07900
负责人：
李コウ
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Center of Neurology and Psychiatry
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

Pelizaeus-Merzbacher病は先天性大脳白質形成不全の代表的な疾患である。従来、変異体の髄鞘膜蛋白質PLP1は、過剰な小胞体ストレスによって細胞に起こるunfolded protein response（UPR）によりoligodendrocytes (OLs)細胞死を誘導するものと考えられて来た。しかし、細胞死シグナル経路を抑制してもモデル動物の症状を改善できないことから、他の細胞病態の介在が示唆されている。最近我々は、変異体PLPはUPRとミトコンドリア膜電位低下を誘導する現象から、過剰な小胞体ストレスによって、小胞体のCa2+恒常性維持が破綻し、ミトコンドリア・小胞体接触部位(MAM)を介して小胞体からミトコンドリアに過剰なCa2+が流入して、ミトコンドリア機能の破綻が起こるという新規病態仮説を提唱し、このモデルの検証と細胞分子機序の解明を行う。本研究の計画は以下の3項目について、順次解析を進めていく。①変異体PLP1のOLsにおける小胞体Ca2+の恒常性障害の検証。②変異体PLP1による、ミトコンドリアの機能障害及びCa2+恒常性障害の検証。③小胞体に蓄積した変異体PLP1がMAMを介しミトコンドリアの機能障害を引き起こす分子メカニズムの解明。本年度は主に①について検証した。HeLa細胞、Oli-neu細胞に小胞体のCa2+インジケーター（G-CEPIAer）発現ベクターと変異体PLP1を共発現し、小胞体Ca2+動態シグナルを蛍光強度で評価した。更に、OLs特異的プロモーター下にG-CEPIAerを発現するAAVベクターを作成し、Msdマウスの脳に直接投与し、in vivoでOLsにおける小胞体Ca2+シグナルを検証した。その結果、変異体PLP1による細胞株及びマウスのOLsにおける小胞体のCa2+枯渇を引き起こすことを明らかにした。

Pelizaeus-Merzbacher病是一种典型的先天性脑白质发育不全。此前，突变髓磷脂膜蛋白 PLP1 被认为可通过细胞内因过度内质网应激而发生的未折叠蛋白反应 (UPR) 诱导少突胶质细胞 (OL) 死亡。然而，抑制细胞死亡信号通路并不能改善模型动物的症状，这表明还涉及其他细胞病理。最近，我们发现突变的PLP会导致UPR和线粒体膜电位降低，过度的内质网应激会破坏内质网Ca2+稳态，导致线粒体-内质网接触位点（MAM）的Ca2+稳态破坏。提出了一个新的病理学假说，过量的Ca2+从内质网流入线粒体，导致线粒体功能崩溃，我们将验证这个模型并阐明细胞分子机制。本研究计划依次分析以下三项。 ① 突变PLP1 OLs内质网Ca2+稳态紊乱的验证。 ②验证PLP1突变引起的线粒体功能障碍和Ca2+稳态紊乱。 ③阐明在内质网中积累的突变PLP1通过MAM导致线粒体功能障碍的分子机制。今年我们主要验证了①。我们在HeLa细胞和Oli-neu细胞中共表达内质网Ca2+指示剂（G-CEPIAer）表达载体和突变体PLP1，并通过荧光强度评估内质网Ca2+动态信号。此外，我们创建了在 OLs 特异性启动子下表达 G-CEPIAer 的 AAV 载体，并将其直接施用到 Msd 小鼠的大脑中，以检查体内 OLs 中的内质网 Ca2+ 信号。结果表明，突变的 PLP1 导致细胞系和小鼠 OL 中内质网 Ca2+ 耗竭。