胎児の左右軸形成異常を引き起こす糖尿病母胎環境と分子メカニズムの解析

糖尿病母体环境及导致胎儿左右轴发育不良的分子机制分析

基本信息

批准号：
22K07871
负责人：
北島桂子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07871/
关键词：
妊娠糖尿病左右軸 Wntシグナル CRISPR-Cas9 糖尿病マウス初期胚

项目摘要

ストレプトゾトシンを腹腔内投与することにより糖尿病を誘発した母体から得られた胎児では、母体血糖値と心臓の左右形態異常の頻度、側板中胚葉でのPitx2の発現パターンに相関性が見られた。これらの胚では右側相同が発生することを既に報告しているが、与える飼料のロットにより左側相同が出現することがわかった。また、Wnt3aのエンハンサー解析の一環として、CRISPR-Cas9法によりexon1を欠損したWnt3aΔex1マウスを新たに作出し、既報のWnt3a null胚と同様に左右軸の異常も再現されることを確認した。しかしながら、心臓形態異常の出現頻度は給餌ロットにより変動することが新たにわかった。一方、研究代表者はWntの阻害因子であるSecreted Frizzled Related Protein (Sfrp)が8日胚の側板中胚葉で左右非対称に発現することを見出した。そこでSfrp1、Sfrp2、Sfrp5に着目し、それぞれの側板中胚葉における発現を制御するシス配列を特定するため、ChIP-Atlasを用いて候補領域を絞り込み、BACトランスジェニックレポーター法によりエンハンサー解析を行った。2022年度においては、まずSfrp5の側板中胚葉エンハンサー(LPME)領域を約500bpに特定し、Sfrp5_LPME-hspLacZトランスジェニック8.0日胚の側板中胚葉におけるレポーター活性を確認した。またSfrp5のLPMEを欠失させたBACをトランスジェニック法で評価したところ、側板中胚葉でのレポーター活性の左右差は減弱することがわかった。

在腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病的母亲获得的胎儿中，观察到母体血糖水平、双侧心脏形态异常的频率和侧板中胚层中 Pitx2 的表达模式之间存在相关性。我们已经报道过这些胚胎中存在右侧同源性，但我们发现左侧同源性的出现取决于所给饲料的数量。此外，作为Wnt3a增强子分析的一部分，我们使用CRISPR-Cas9方法新生成了缺乏外显子1的Wnt3aΔex1小鼠，并证实左右轴异常与之前报道的Wnt3a无效胚胎一样再现。然而，新发现心脏异常的发生频率因饲养场而异。与此同时，主要研究人员发现，Wnt 抑制剂 Secret Frizzled 相关蛋白 (Sfrp) 在 8 日龄胚胎的侧板中胚层中不对称表达。因此，我们重点关注Sfrp1、Sfrp2和Sfrp5，为了鉴定控制它们在侧板中胚层中表达的顺式序列，我们使用ChIP-Atlas缩小了候选区域的范围，并使用BAC转基因报告基因方法进行了增强子分析。 2022年，我们首次鉴定了Sfrp5的约500 bp的侧板中胚层增强子（LPME）区域，并证实了Sfrp5_LPME-hspLacZ转基因8.0日龄胚胎的侧板中胚层中的报告基因活性。此外，当我们使用转基因方法评估删除了Sfrp5的LPME的BAC时，我们发现侧板中胚层中报告基因活性的左右差异减弱。