薬剤耐性・変異株解析可能なリアルタイム次世代シークエンスによる重症感染症迅速診断

使用实时下一代测序快速诊断严重传染病，从而分析耐药性和突变株

• 批准号: 22K07818
• 负责人: 伊藤 嘉規
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07818/
• 关键词: 次世代シークエンス; リアルタイムシークエンス法; ロングリード法; 重症感染症; 病原微生物診断; リアルタイムシークエンス; 薬剤耐性; ウイルス変異株; 感染症診断

重症感染症では、早期診断と適切な抗微生物薬の選択が予後を左右する。そのため、感染症病原診断に現時点で最も優れた可能性をもつロングリード法(5-20kbpの遺伝子断片を解析)・次世代シークエンス法による新規診断法の開発を行う。遺伝子断片の網羅的解析を行うことから、解析検体中のマイクロバイオーム、病原微生物の薬剤耐性遺伝子、ウイルスの変異株を平行して解析可能である。ロングリード法に使用するナノポアシークエンサーは、遺伝子配列の解析に同時平行して解析情報を見ることが可能なため、短時間で微生物を同定することが可能であり「リアルタイムシークエンス法」と表現できる。リアルタイムシークエンス法では、6時間程度で、薬剤耐性情報を含む網羅的な微生物診断が可能となる。ナノポアシークエンサーには、解読精度がショートリードより劣る欠点があり、臨床応用可能なプロトコールの開発が不十分な状況であるが、技術改良が進んでいる。本研究では、重症感染症の網羅的・迅速診断法としてのリアルタイムシークエンス法の基盤的検証を行う。2022年度は、人工呼吸器管理を要した小児重症呼吸不全患者10例の気管支肺胞洗浄液からRNAを抽出し、リアルタイムシークエンス法およびショートリードシークエンス法で解析し、比較検討した。リアルタイムシークエンス法/ショートリードシークエンス法ともに同一の6例でRSウイルス、エンテロウイルスなどが検出された。リアルタイムシークエンス法とショートリードシークエンス法で総塩基数を揃えた後に、各ウイルスのgenome coverageを比較したところ、リアルタイムシークエンス法が高いcoverageを示すものが多かった。

对于严重感染，早期诊断和适当选择抗菌药物决定预后。因此，我们将利用长读长方法（分析5-20 kbp的基因片段）和下一代测序方法来开发新的诊断方法，这些方法目前在诊断传染病的发病机制方面最有潜力。通过对基因片段进行综合分析，可以同时分析分析样本中的微生物组、病原微生物耐药基因以及病毒突变株。长读长方法中使用的纳米孔测序仪可以在基因序列分析的同时查看分析信息，从而可以在短时间内识别微生物，可以说是“实时测序方法”。实时测序可在约 6 小时内实现全面的微生物诊断，包括耐药性信息。纳米孔测序仪的缺点是解码精度不如短读长，临床适用的方案开发还不够，但技术改进正在取得进展。在本研究中，我们将对实时测序作为严重传染病综合快速诊断方法进行基础验证。 2022财年，从10名需要呼吸机管理的严重呼吸衰竭儿科患者的支气管肺泡灌洗液中提取了RNA，使用实时测序和短读长测序进行分析并进行比较。使用实时测序和短读长测序在相同的 6 例病例中检测到 RSV、肠道病毒等。使用实时测序和短读长测序比对碱基总数后，我们比较了每种病毒的基因组覆盖度，发现实时测序在许多情况下表现出更高的覆盖度。