ミトコンドリアスフェロイド化不全を起点としたドーパミン神経細胞死の機序解明

阐明线粒体球化缺陷引起多巴胺能神经元死亡的机制

• 批准号: 22K07523
• 负责人: 横田 睦美
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07523/
• 关键词: PRKN変異; TH-GFP iPS細胞; ドーパミン神経細胞; 近接ライゲーションアッセイ; ドーパミン神経細胞死; 光顕・電顕相関観察; トランスクリプトーム

本研究ではiPS細胞由来ドーパミン神経細胞をGFP標識することによりドーパミン神経特異的なミトコンドリア機能・形態解析を可能にし、パーキンソン病におけるドーパミン神経特異的なオルガネラの構造変化や変性機序を見出すことを主目的としている。本研究ではこれまでに樹立したドーパミン神経マーカーTyrosine Hydroxylase（TH）遺伝子にGFP遺伝子をノックインした健常者及びPRKN変異患者TH-GFP iPS細胞株を用いている。TH-GFP iPS細胞由来GFP陽性ドーパミン神経細胞のトランスクリプトーム解析からミトコンドリアと小胞体の接触部位（ERMCS）に着目した。GFP陽性ドーパミン神経細胞の光顕電顕相関観察と近接ライゲーションアッセイの結果、PRKN変異患者においてERMCSの減少が認められ、ミトコンドリアストレスCCCP処理によりさらにERMCSが減少することが明らかになった。TH-GFP iPS細胞とは別のPRKN変異患者iPS細胞由来ドーパミン神経細胞においても近接ライゲーションアッセイを行ったところ同様の傾向が認められた。また、小胞体からミトコンドリアへのカルシウムイオン流入について解析するため、GFP陽性ドーパミン神経細胞においてレンチウイルスを介してCEPIA3mtを発現させ、ヒスタミン刺激によるCEPIA3mtの蛍光強度変化を測定した。その結果、患者ドーパミン神経細胞においてヒスタミン刺激によるミトコンドリアへのカルシウムイオン流入が減少していることも明らかになった。

在本研究中，我们将通过用GFP标记iPS细胞来源的多巴胺神经元来分析多巴胺能神经元特异性线粒体功能和形态，我们的主要目标是发现多巴胺能神经元特异性细胞器的结构变化和退化机制。目的是帕金森病。在这项研究中，我们使用了健康受试者和 PRKN 突变患者的 TH-GFP iPS 细胞系，其中 GFP 基因被敲入先前建立的多巴胺能神经元标记酪氨酸羟化酶 (TH) 基因。 TH-GFP 我们通过对源自 iPS 细胞的 GFP 阳性多巴胺能神经元进行转录组分析，重点关注线粒体 - 内质网接触位点 (ERMCS)。光镜电子显微镜相关观察和GFP阳性多巴胺能神经元的邻近结扎测定的结果，观察到PRKN突变患者的ERMCS降低，并且揭示了通过线粒体应激CCCP治疗，ERMCS进一步降低。当对源自 PRKN 突变患者 iPS 细胞（与 TH-GFP iPS 细胞不同）的多巴胺能神经元进行邻近连接测定时，观察到类似的趋势。此外，为了分析钙离子从内质网流入线粒体，我们通过慢病毒在GFP阳性多巴胺能神经元中表达CEPIA3mt，并测量组胺刺激后CEPIA3mt荧光强度的变化。结果还显示，在患者的多巴胺能神经元中，组胺刺激的钙离子流入线粒体减少。

项目成果

TH-GFP iPS細胞由来ドパミン作動性ニューロンを用いた 神経突起内ミトコンドリア膜電位のライブイメージング解析

使用 TH-GFP iPS 细胞来源的多巴胺能神经元对神经突内线粒体膜电位进行实时成像分析

• 发表时间: 2023
• 作者: 西島暁彦;横田睦美;小池正人
• 通讯作者: 小池正人