高速原子間力顕微鏡を用いた凝集タンパクのクロス・シーディング効果の時空間的観察

使用高速原子力显微镜观察聚集蛋白的交叉播种效应

基本信息

批准号：
22K07514
负责人：
小野賢二郎
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

アルツハイマー病やレビー小体病（パーキンソン病、レビー小体型認知症）では、アミロイドβ蛋白(amyloid β-protein: Aβ)やαシヌクレイン蛋白(α-synuclein protein: αS)の単独あるいは混合で形成された凝集体が関与している可能性が示唆されている。これまでに我々は、AβあるいはαSの重合核(シード)を用いた凝集反応(セルフ・シーディング)を種々検討している。本研究では、AβとαSとの間での凝集反応(クロス・シーディング)の検討を行い、その凝集促進効果の有無や機序を明らかにすることを目的として研究を展開している。AβとαSのセルフおよびクロス・シーディングにおいて、各蛋白のシードの調整法がその凝集反応速度に影響を及ぼす可能性が考えられることから、本年度では、まず、種々の方法でAβ42およびαSのシードを調整した。なお、Aβ42は市販のものを用い、αSは大腸菌より調整し精製たものを用いた。得られた各シードを用い、チオフラビンT(thioflavin T: ThT)を利用した系でセルフ・シーディングについて種々検討した結果、調整法により凝集反応に差がみられることを明らかにした。また、Aβ42のセルフ・シーディングについて、高速原子間力顕微鏡(high-speed atomic force microscopy: HS-AFM)を利用した凝集反応の動的観察も検討しており、シードの調整法や測定条件により凝集反応が大きく影響されることを明らかにした。次に、ThTを利用した系でAβ42とαSのクロス・シーディングを種々検討したところ、現在の条件ではクロス・シーディングの凝集促進効果が小さく、HS-AFMで評価可能な時間内で動的観察が困難であることが明らかとなり、シード調整や凝集反応の条件(緩衝液や塩濃度、pHなど)最適化が必要であることが示唆された。

在阿尔茨海默病和路易体病（帕金森病、路易体痴呆）中，β淀粉样蛋白（Aβ）和α-突触核蛋白（αS）可能单独或组合形成。迄今为止，我们已经研究了使用 Aβ 或 αS 聚合核（种子）的各种聚集反应（自播种）。在本研究中，我们正在研究Aβ和αS之间的聚集反应（交叉播种），并阐明其聚集促进作用的存在和机制。在Aβ和αS的自体和交叉接种中，调整每种蛋白质的种子的方法可能会影响调整的聚集反应速率。使用市售的Aβ42，从大肠杆菌中制备并纯化αS。使用所获得的各种子，在使用硫代黄素T(ThT)的系统中进行自播种的各种研究的结果表明，根据制备方法，凝集反应存在差异。关于Aβ42的自接种，我们还考虑使用高速原子力显微镜（HS-AFM）动态观察凝集反应，结果表明凝集反应受到很大影响。接下来，我们在使用ThT的系统中研究了Aβ42和αS之间的各种类型的交叉播种，发现在当前条件下，交叉播种对促进聚集的效果很小，并且动态观察变得很困难，建议优化种子制备和凝集反应条件（缓冲液、盐浓度、pH等）。