ヒト化ボツリヌス毒素抗体の抗体医薬品としての応用

人源化肉毒毒素抗体作为抗体药物的应用

• 批准号: 22K07055
• 负责人: 幸田 知子
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Osaka Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07055/
• 关键词: ボツリヌス神経毒素; モノクローナル抗体; ボツリヌス毒素; ボツリヌス毒素抗体; 抗体医薬品

申請者が所属する研究室で開発された抗ボツリヌスE型神経毒素（BoNT/E）完全ヒト化モノクローナル抗体（hmE9-4）は、BoNT/Eの酵素活性ドメインである軽鎖（L/E）を認識し、単独、かつ、ごく低用量でBoNT/Eの毒素活性を中和する。hmE9-4のBoNT/E毒素中和機構を明らかにするために本年度は、ELISAとhmE9-4のエピトープに関わる領域の同定とhmE9-4とL/Eの分子間相互作用をELISAと等温滴定型カロリメトリー（ITC）により測定した。L/EとｈｍE9-4の構造情報を基にしたドッキングシミュレーションソフトから予想された領域2か所（m2, m3）とL/Eの疎水性ポケットの一つで234-244までの連続した領域で250 loopと呼ばれる不安定で結晶化されない部分（m4, m5, m6）をターゲットとした。さらにL/Eの酵素活性中心である亜鉛結合モチーフの点変異体（m8）を加えて合計7つのL/E変異体を作製した。野生型L/Eおよび変異体L/Eを抗原とし、ELISAを行った。hmE9-4を1次抗体、2次抗体に検出用のgoat anti-human IgGを反応させ、基質を発色させた。m3だけが優位に結合の低下が見られた。さらに、hmE9-4とL/E分子間の相互作用をITCで測定した。1 μMのL/Eに対し、10 μMのhmE9-4をリガンドとし滴下すると発熱が観察され飽和状態に達した。ｈｍE9-4 1分子に2分子のL/Eが結合し、解離定数は約0.57 x 10^10 Mと高く、イオン結合や水素結合によって起こるエンタルピー変化であることが分かった。また、m3 L/Eの解離定数は、約16.0 x 10^10 Mで、野生型L/Eがm3 L/EよりもhmE9-4に対し高い結合親和性を持っており、ELISAの結果と一致した。

申请人实验室开发的抗E型肉毒杆菌神经毒素（BoNT/E）全人源化单克隆抗体（hmE9-4）基于轻链（L/E），该轻链是BoNT/E的酶活性结构域，并以非常低的剂量单独中和 BoNT/E 的毒素活性。为了阐明hmE9-4的BoNT/E毒素中和机制，今年我们将利用ELISA鉴定与hmE9-4表位相关的区域，并利用ELISA测量hmE9-4与L/E之间的分子间相互作用和等温滴定法（ITC）测量。根据 L/E 和 hmE9-4 的结构信息，通过对接模拟软件预测出两个区域（m2、m3），以及 L/E 疏水袋之一中从 234 到 244 的连续区域。部分（m4、m5、m6）称为 250 个循环。此外，添加了锌结合基序（L/E 的酶活性中心）的点突变体（m8），总共产生了 7 个 L/E 突变体。使用野生型L/E和突变型L/E作为抗原进行ELISA。通过使 hmE9-4 与一抗和山羊抗人 IgG 反应来对底物进行着色，以便用二抗进行检测。仅 m3 显示结合显着减少。此外，ITC 还测量了 hmE9-4 和 L/E 分子之间的相互作用。当10μM的hmE9-4作为配体添加到1μM的L/E中时，观察到发热并达到饱和。两个L/E分子与一个hmE9-4分子结合，解离常数高达约0.57 x 10^10 M，发现这是由离子键和氢键引起的焓变。此外，m3 L/E的解离常数约为16.0 x 10^10 M，表明野生型L/E对hmE9-4的结合亲和力高于m3 L/E，这与ELISA结果一致。 。

项目成果

ヒト化ボツリヌスE型神経毒素中和抗体の性状

人源化肉毒杆菌E神经毒素中和抗体的特性

• 发表时间: 2022
• 作者: 幸田知子;門間大;片平じゅん;向本雅郁
• 通讯作者: 向本雅郁