Drug discovery through identification of microbial products against SARS-CoV-2 proteases

通过鉴定抗 SARS-CoV-2 蛋白酶的微生物产物来发现药物

基本信息

批准号：
22K06692
负责人：
山崎学
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Microbial Chemistry Research Foundation
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

次世代のCOVID-19治療薬のバックアップを整備することは、薬剤耐性化や新たなコロナウイルスの出現に迅速に対応する上で重要である。本研究では、リード化合物創製の起点となる母核構造の提案を目指して、医薬品開発にインスピレーションを与えた天然物化合物に着目する。そこで、微生物培養液をソースとして、原因ウイルスのSARS-CoV-2に必須の２種のプロテアーゼを阻害する化合物を同定・最適化することを目的とする。初年度は当初の計画に沿って、（１）メインプロテアーゼ（Mpro）を阻害するヒット培養液中の活性成分の精製、（２）パパイン様プロテアーゼ（PLpro）のスクリーニング、および（３）各プロテアーゼの培養細胞評価系の構築を実施した。（１）研究開始時、培養液8,280サンプルのスクリーニングからMproを阻害する18サンプルを得ており、これらをC18逆相カラムにて分取した。活性分画について還元剤の影響やカテプシンBに対する選択性を評価し、有望なプロファイルを示す複数の培養液を見出した。（２）PLproについては培養液2,880サンプルをスクリーニングし、134サンプルのヒットを得た。次にパパインを用いたカウンターアッセイにより、選択性を示す19サンプルを見出した。（３）同定した（または精製途中の）活性成分の細胞での作用を評価するために、Mpro（またはPLpro）とスプリットNanoLuc（切断配列を挟み込んだルシフェラーゼレポーター）を共発現するプラスミドを構築した。Mpro発現プラスミドを293T細胞に導入した結果、NanoLucの切断による発光の低下を認めた。活性中心変異体では発光が維持したことから、Mpro特異的な切断が示された。一方、PLpro発現プラスミドでは、活性中心変異体でも複数の細胞株でNanoLucの切断が起こり、宿主プロテアーゼによる作用が示唆された。

建立下一代 COVID-19 治疗药物的备用供应对于快速应对耐药性和新型冠状病毒的出现非常重要。在这项研究中，我们将重点关注为药物开发提供灵感的天然化合物，旨在提出一个可以作为创建先导化合物的起点的核心结构。因此，我们的目标是利用微生物培养液作为来源来识别和优化抑制致病病毒 SARS-CoV-2 所必需的两种蛋白酶的化合物。第一年，按照原计划，我们进行了（1）对hit培养物中抑制主要蛋白酶（Mpro）的活性成分进行纯化，（2）筛选类木瓜蛋白酶（PLpro），以及（ 3）对每种蛋白酶进行筛选。我们构建了培养细胞评价体系。 (1)研究开始时，通过筛选8,280份培养液样品，获得18份抑制Mpro的样品，并使用C18反相柱对这些样品进行分级。我们评估了还原剂和组织蛋白酶 B 选择性对活性组分的影响，并发现了几种显示出有前景的培养液。 (2)关于PLpro，筛选了2,880个培养液样本，获得了134个命中。接下来，使用木瓜蛋白酶进行的反分析显示 19 个样品具有选择性。 (3)为了评价已鉴定的(或在纯化过程中)活性成分在细胞中的作用，构建了共表达Mpro(或PLpro)和分裂NanoLuc(夹有切割序列的荧光素酶报告基因)的质粒。当将 Mpro 表达质粒引入 293T 细胞时，观察到由于 NanoLuc 裂解而导致发光减少。活性中心突变体保持发光，表明 Mpro 特异性切割。另一方面，在PLpro表达质粒中，即使在活性中心突变体中，多个细胞系中也发生NanoLuc裂解，表明宿主蛋白酶的作用。