ラマンプローブによる可逆的チアMichael反応の生細胞解析

使用拉曼探针对可逆 Thia-Michael 反应进行活细胞分析

• 批准号: 22K06495
• 负责人: 山越 博幸
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06495/
• 关键词: ラマンプローブ; ラマン分光; チアMichael反応; チオール; Michael受容体; ラマン; イメージング; ニトリル; チアマイケル

研究初年度は、主に水溶液を用いたチアMichael反応の解析に取り組んだ。２-メルカプトエタノールを用いた既知の可逆的チアMichael反応をモデルとして、不飽和カルボニル化合物とチオール付加生成物の比をプロトンNMRにより解析した。同反応をラマン解析した結果、その比はプロトンNMR解析と良い一致を示した。以上の結果より、筆者の企図したラマン解析法の妥当性を実証できた。続いて、不飽和カルボニル化合物を固定し、置換様式の異なる約１０種類のチオール間の反応性の違いを検証した。直鎖状のチオールと比べ、β分岐チオールは立体障害のため生成物の安定性が乏しいことがわかった。一方で、１５種の不飽和カルボニル化合物を合成し、２-メルカプトエタノールに対するMichael受容能を評価した。電子不足な置換基を導入するほど付加生成物の割合が増加した。以上の知見を元に、可逆的チアMichael反応の生細胞解析用のラマンプローブXを開発した。濁度評価により、同プローブがリン酸緩衝液にミリモル濃度で完全に溶解することを確認した。次に、ラマンプローブXの細胞溶解液中での応答性を評価した。チアMichael反応の平衡を不飽和カルボニル化合物へと移動させる外的刺激のモデルとして、チオール捕捉剤N-エチルマレイミド（NEM）の効果を調べた。ラマン解析の結果、NEMの添加後数分で不飽和カルボニル化合物の比率の上昇を確認できた。現在は、ラマンプローブXの生細胞解析を試みている。

在我研究的第一年，我主要从事使用水溶液的Thia-Michael反应的分析。使用已知的可逆硫杂-迈克尔反应，以2-巯基乙醇为模型，通过质子NMR分析不饱和羰基化合物与硫醇加成产物的比率。同一反应的拉曼分析结果表明，该比例与质子NMR分析非常一致。从以上结果，我们能够证明作者提出的拉曼分析方法的有效性。接下来，固定不饱和羰基化合物，验证了约10种不同取代方式的硫醇之间的反应性差异。与直链硫醇相比，β-支链硫醇由于空间位阻而导致产品稳定性较差。另一方面，合成了15种不饱和羰基化合物，并评价了它们对2-巯基乙醇的迈克尔接受能力。随着更多缺电子取代基的引入，加成产物的比例增加。基于上述知识，我们开发了拉曼探针X，用于可逆硫杂-迈克尔反应的活细胞分析。浊度评估证实探针在毫摩尔浓度下完全溶解在磷酸盐缓冲液中。接下来，评估拉曼探针X在细胞裂解液中的响应性。我们研究了硫醇清除剂 N-乙基马来酰亚胺 (NEM) 作为外部刺激模型的影响，该模型将 Thia-Michael 反应的平衡转向不饱和羰基化合物。拉曼分析的结果证实，添加NEM后几分钟内不饱和羰基化合物的比例增加。目前，我们正在尝试使用 Raman Probe X 分析活细胞。