試験管内再構成系を用いた構成的ヘテロクロマチン維持の構造基盤の解析

使用体外重建系统分析组成型异染色质维持的结构基础

基本信息

批准号：
22K06179
负责人：
佐藤祥子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

真核生物のゲノムDNAは、ヒストンH2A、H2B、H3、H4からなるヒストン八量体にDNAが巻きついたヌクレオソームを基本単位としたクロマチンを形成し、細胞核内に収納されている。遺伝子を多く含み転写活性化したユークロマチンに対し、繰り返し配列を多く含む構成的ヘテロクロマチンは、転写やDNA組換えが抑制されゲノムの安定化に寄与していると考えられている。本研究は、構成的ヘテロクロマチンのエピジェネティックマークの書き込み酵素を含むクロマチンを試験管内で再構成し、クライオ電子顕微鏡を用いて立体構造を解析することにより、ヘテロクロマチンの形成と維持の機構を明らかにすることを目的としている。2022年度は、構成的ヘテロクロマチン領域のヒストンH3の9番目のリシン残基にメチル基を導入する（H3K9me2/3）ヒストンメチル基転移酵素がクロマチン上でヌクレオソームをメチル化する機構を解析するため、ヒストンメチル基転移酵素を精製した。また、H3K9me2/3に適したクロマチン基質を検索するため、様々なヌクレオソームを試験管内において再構成した。精製したヒストンメチル基転移酵素に対し、試験管内で再構成したヌクレオソームを基質としたメチル化活性試験および結合性試験を行い、ヒストンメチル基転移酵素によるH3K9me2/3が効率的に起こるヌクレオソーム基質を見出すことに成功した。クライオ電子顕微鏡観察に必要量のヒストンメチル基転移酵素-ヌクレオソーム複合体を調製するため、精製系の構築を進めた。

真核生物的基因组DNA形成染色质，其基本单位是核小体，其中DNA包裹在由组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成的组蛋白八聚体上，储存在细胞核中。与含有许多基因并且具有转录活性的常染色质相反，组成型异染色质含有许多重复序列，被认为可以抑制转录和 DNA 重组，并有助于基因组的稳定性。在这项研究中，我们通过在体外重构含有酶的染色质来阐明异染色质的形成和维持机制，并使用冷冻电子显微镜分析其三维结构。 2022年，我们将分析组蛋白甲基转移酶（H3K9me2/3）在组成型异染色质区域的组蛋白H3的第9个赖氨酸残基上引入甲基，使染色质上的核小体甲基化的机制，并纯化组蛋白甲基转移酶。此外，为了寻找H3K9me2/3合适的染色质底物，在体外重建了各种核小体。使用重组核小体作为体外底物对纯化的组蛋白甲基转移酶进行甲基化活性和结合测试，以发现组蛋白甲基转移酶有效发生H3K9me2/3的核小体底物。为了制备冷冻电镜所需量的组蛋白甲基转移酶-核小体复合物，我们继续构建纯化系统。