電気生理-蛍光変化同時計測系によるプロトンチャネルの制御機構解析

使用电生理-荧光变化同步测量系统分析质子通道的控制机制

基本信息

批准号：
22K06170
负责人：
川鍋陽
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kagawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

申請者は、本研究開始前に膜電位に応じてプロトンを透過する電位依存性プロトンチャネルHv1において、細胞内側の“ATP”や“N末端ドメイン”が制御因子である可能性を見出した。そこで、Hv1の制御因子となる細胞内分子・ドメインの相互作用部位および作用メカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度は、Hv1に対するATP効果の定量化を目的として、電気生理学的実験を実施した。ATPの効果を定量化するために、細胞膜から膜の一部を切り取ったインサイドアウト膜を形成した上で、細胞内側からATP濃度を調整しながら、Hv1のプロトン電流の計測を行った。その結果、生理的なATP濃度(2mM)で電流上昇効果があることが判明した。さらなる高濃度での測定も実施したが電流は上昇し続け、20mMでも飽和することはなかった(これ以上は測定できていない)。続いて、このATP効果が、直接的・間接的のどちらであるのか検討するために、ATPアナログによる電流への効果の定量を行った。ATPは、生体内で重要な生理作用をいくつも担うために他のイオンチャネルでは間接的な影響を与えることが多く(特にイノシトールリン脂質PI(4,5)P2の代謝に関わる)、このような評価は大変重要となる。Adenosine, AMP, ADP, ATPと効果を検証すると、リン酸基が多いものほど効果が大きいことが明らかとなった。また、ATPの代謝不活化型アナログであるAMP-PCPを用いた所、ATPと同等の効果が得られた。以上の事から、ATPはHv1に対して直接的に作用することで、影響を与えていると考えられた。

在开始这项研究之前，申请人发现细胞内的“ATP”和“N端结构域”可能是电压门控质子通道Hv1中的调节因子，该通道根据膜电位传输质子。因此，我们的目标是阐明作为 Hv1 调节因子的细胞内分子和结构域的相互作用位点和作用机制。今年，我们进行了电生理学实验来量化 ATP 对 Hv1 的影响。为了量化 ATP 的作用，我们通过切掉一部分细胞膜形成了由内而外的膜，然后在从细胞内部调整 ATP 浓度的同时测量 Hv1 质子电流。结果发现，生理ATP浓度(2mM)具有电流增加效果。在更高浓度下也进行了测量，但电流持续上升，即使在 20mM 下也没有达到饱和（无法进一步测量）。接下来，为了检查这种 ATP 效应是直接的还是间接的，我们量化了 ATP 类似物对电流的影响。由于ATP在体内发挥着许多重要的生理功能，因此它常常对其他离子通道有间接的影响（特别是参与肌醇磷脂PI(4,5)P2的代谢）的评价非常重要。在检查腺苷、AMP、ADP 和 ATP 的作用时，我们发现磷酸基团越多，作用就越大。此外，当使用ATP的代谢失活类似物AMP-PCP时，获得了与ATP相同的效果。由上可知，ATP直接作用于Hv1而对Hv1产生影响。