昆虫系統を特徴づける細胞間接着構造の解明と機能分子デザインへの応用

阐明昆虫谱系特征的细胞间粘附结构及其在功能分子设计中的应用

基本信息

批准号：
22K05686
负责人：
小田広樹
金额：
$ 2.66万
依托单位：
JT Biohistory Research Hall
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

クラシカルカドヘリンを接着成分とする細胞間接着システムは動物細胞の自己組織化能力と形態形成能力の基盤を成す分子装置である。細胞間の接着界面を構成するカドヘリン細胞外領域は分子長の大きな状態を祖先として、脊椎動物と昆虫の系統で独立に起ったドメイン欠失で異なった短縮化を受けたと考えられている。このことから脊椎動物と昆虫の細胞間接着の構造的仕組みは大きく異なることが示唆されるが、脊椎動物以外でカドヘリン分子間の結合様態を説明するデータは乏しい。本研究では、ショウジョウバエの２つのクラシカルカドヘリン、派生型（昆虫系統特異型、分子長が小さい）DEカドヘリンと祖先型（左右相称動物広範分布型、分子長が大きい）DNカドヘリンに注目し、クラシカルカドヘリンの接着原理と進化原理の解明に挑む。研究の第一段階は、直方体にデザインしたDNAオリガミ構造体を用いてカドヘリンの接着状態をin vitroで再構成し、接着界面の分子様態を直接観察できる実験系を構築することである。22年度の研究では、DNAオリガミ構造体のひとつの側面に等間隔に５カ所のビオチン（bio）修飾部位を設置し、そこにストレプトアビジン（SA) が確実に結合することを、アガロース電気泳動、透過型電子顕微鏡、高速原子間力顕微鏡を用いて確認した。さらに、精製したDEカドヘリンの細胞外領域の断片をSNAPタグを介してビオチン化し、それをDNAオリガミ-bio-SA構造体に連結できることを確認した。並行して、ビオチン化したカドヘリン断片がSAでコートされたマイクロ磁性ビーズ（SAビーズ）に混和後速やかに連結し、短時間の振盪でカドヘリンを介した集合形成が起こることを確認した。この集合形成条件において、SAビーズ表面のカドヘリン分子の平均密度を概算することができ、DNAオリガミ上に配置したbio修飾部位の間隔距離の妥当性を評価することができた。

细胞间粘附系统使用经典的钙粘蛋白作为粘附成分，是动物细胞自组织和形态发生能力基础的分子装置。构成细胞间粘附界面的钙粘蛋白的胞外结构域被认为具有较长的分子祖先，并且由于在脊椎动物和昆虫谱系中独立发生的结构域缺失而经历了不同的缩短。这表明脊椎动物和昆虫之间细胞-细胞粘附的结构机制存在显着不同，但解释脊椎动物之外的钙粘蛋白分子之间的结合模式的数据却很少。在本研究中，我们重点研究了果蝇的两种经典钙粘蛋白，衍生型（昆虫谱系特异性型，小分子长度）DE钙粘蛋白和祖先型（双侧动物广泛分布型，大分子长度）DN钙粘蛋白，以及试图阐明经典钙粘蛋白的粘附原理和进化原理。研究第一步是利用设计成长方体的DNA折纸结构在体外重建钙粘蛋白的粘附状态，并构建可以直接观察粘附界面分子行为的实验系统。在我们2017年的研究中，我们在DNA折纸结构的一侧等间隔地安装了5个生物素（bio）修饰位点，并通过琼脂糖电泳证实了链霉亲和素（SA）与这些位点结合，并使用透射电子显微镜证实了这一点和高速原子力显微镜。此外，我们证实纯化的 DE-钙粘蛋白胞外结构域片段可以通过 SNAP 标签进行生物素化，并连接到 DNA origami-bio-SA 构建体上。同时，我们证实生物素化的钙粘蛋白片段在混合后快速连接到SA包被的微磁珠（SA珠），并且钙粘蛋白介导的组装形成在短暂的摇动下发生。在这些组装形成条件下，我们能够粗略地估计SA珠表面上钙粘蛋白分子的平均密度，并且能够评估DNA折纸上生物修饰位点之间的间距的有效性。