Elucidation of the biogenesis mechanism of amine dehydrogenase by development of a low-cytotoxicity genome editing technique for bacteria

通过开发细菌低细胞毒性基因组编辑技术阐明胺脱氢酶的生物发生机制

基本信息

批准号：
22K05419
负责人：
中井忠志
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Hiroshima Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、タンパク質の翻訳後修飾反応により形成されるビルトイン型キノン補酵素、システイントリプトフィルキノン（CTQ）を有するキノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素（QHNDH）を対象とした。特に、最後まで未解明のままになっているCTQの生成機構を明らかにすることで、多段階の翻訳後修飾反応によるQHNDHの生合成プロセスを統合的に解明することと、QHNDH生産菌であるParacoccus denitrificansに適用可能な細菌の低細胞毒性ゲノム編集技術を確立することも目的とした。2022年度は、広宿主域ゲノム編集用プラスミドの構築を中心に研究を実施した。プラスミドベクターとして広宿主域のpBBR122およびpRK415を用いた。Cas9遺伝子は約5000 bpと大きいが、5分割した各断片をpUC19にクローニングした後、Golden Gate Assembly法により再結合すると同時にベクターに挿入した。各断片をクローンごとに改変してから再結合が可能で、複数遺伝子の融合が必要なプラスミドでも無理なく構築できることを確認した。次に、IPTGまたは無水テトラサイクリンの培地への添加により広宿主で発現誘導可能なゲノム編集用プラスミドを構築した。まずは大腸菌に導入し、塩基編集法およびプライム編集法によるlacZ遺伝子の編集を試みたところ、ゲノムに意図する変異を導入できることを確認した。一方、P. denitrificansでの誘導時には、これらプロモーター活性が低いことが判明したため、プロモーターおよびオペレータ配列の最適化を現在進めている。今後は、決定した最適配列に置き換えたプラスミドをP. denitrificansに導入し、qhp遺伝子に変異を導入しQHNDHの翻訳後修飾機構の解析に用いる予定である。

在这项研究中，我们重点研究了醌血红素蛋白胺脱氢酶（QHNDH），它具有半胱氨酸色氨酸醌（CTQ），这是一种由蛋白质翻译后修饰反应形成的内置醌辅酶。特别是，通过阐明直到最后仍不清楚的CTQ的产生机制，我们希望通过多步翻译后修饰反应全面阐明QHNDH的生物合成过程，并鉴定产生QHNDH的细菌。旨在建立适用于脱氮副球菌的低细胞毒性细菌基因组编辑技术。 2022 年，研究重点是构建用于广泛宿主范围基因组编辑的质粒。使用广泛的宿主范围pBBR122和pRK415作为质粒载体。 Cas9基因很大，大约5000 bp，将五个片段分别克隆到pUC19中后，使用Golden Gate Assembly方法进行重组，同时插入载体中。经证实，每个片段都可以针对每个克隆进行修饰然后重组，甚至可以轻松构建需要融合多个基因的质粒。接下来，我们构建了一个基因组编辑质粒，通过在培养基中添加 IPTG 或脱水四环素，可以在多种宿主中诱导表达。首先，我们将其引入大肠杆菌中，并尝试使用碱基编辑和prime编辑方法来编辑lacZ基因，并确认可以将所需的突变引入基因组中。另一方面，我们发现这些启动子在脱氮假单胞菌中诱导时活性较低，因此我们目前正在努力优化启动子和操纵子序列。今后，我们计划将确定的最优序列替换后的质粒导入脱氮假单胞菌中，在qhp基因中引入突变，并用其分析QHNDH的翻译后修饰机制。