高度好熱菌グリシン開裂系超分子複合体のX線構造解析

超高温甘氨酸裂解系统超分子复合物的X射线结构分析

基本信息

批准号：
13780495
负责人：
中井忠志
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

グリシンの生体内での分解反応は4種類のタンパク質(P, H, T, L)からなる多酵素複合体であるグリシン開裂系によつて触媒される。本研究は、グリシン開裂系の構成タンパク質さらにはそれらの複合体のX線結晶構造解析を行うことにより、代謝経路全体を原子レベルで解明することを目的としている。研究方法としては、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のタンパク質を用い、まず単独成分で立体構造を決定し、次にそれらの構造をもとにグリシン開裂系を超分子複合体として構造解析する方針ですすめた。昨年度までに、全構成タンパクの大量発現系の構築と精製をおこない、HおよびLタンパクの構造決定とPタンパクの結晶化に成功している。今年度の研究経過を以下に示す。(1)Pタンパクの結晶化および予備的回折実験:Pタンパクは分子量約20万のα_2β_2テトラマーのビタミンB6酵素であり、グリシン開裂系の第一ステップの反応である脱炭酸反応を触媒する。昨年度に引き続き結晶化条件の最適化をすすめた。c軸が371Åと長いため回折斑点を分離することが課題となっていたが、SPring-8のBL45XUにてR-AXIS Vを検出器に用いて測定したところ分離に成功し、2.4Å分解能のデータセットを収集することができた。結晶は空間群P3_121またはP3_221に属している。溶媒含量および自己回転関数を計算したところ、2回軸で関係付けられた(αβ)_2が非対称単位に1つ存在することがわかった。現在、重原子多重同形置換法による構造決定をすすめている。(2)Hタンパクの構造解析:2.5Å分解能で構造精密化を行った。マメのHタンパクと比較したところ、構造上よく保存されている領域を見出した。また、分子表面の静電ボテンシャルもよく保存されていることから、他の構成タンパクとの相互作用に関与する領域であることが示唆された。

甘氨酸的体内分解反应是由甘氨酸裂解系统催化的，该系统是由四种类型的蛋白质（P、H、T和L）组成的多酶复合物。本研究的目的是通过对甘氨酸裂解系统的组成蛋白及其复合物进行X射线晶体结构分析，在原子水平上阐明整个代谢途径。研究方法是使用源自嗜热栖热菌HB8的蛋白质，首先确定各个成分的三维结构，然后根据这些结构分析作为超分子复合物I的甘氨酸裂解系统的结构。推荐它。到去年，我们已经构建并纯化了所有组成蛋白的大规模表达系统，并成功确定了H和L蛋白的结构，并结晶了P蛋白。今年的研究进展如下所示。 (1)P蛋白的结晶和初步衍射实验：P蛋白是一种α_2β_2四聚体维生素B6酶，分子量约为20万，催化脱羧反应，这是甘氨酸裂解系统的第一步。延续去年，我们不断优化结晶条件。由于 c 轴长达 371 Å，分离衍射斑是一项挑战，但当我们在 SPring-8 的 BL45XU 上使用 R-AXIS V 作为检测器测量它们时，我们成功分离了它们，并实现了我们能够收集分辨率为 2.4 Å 的数据集。该晶体属于空间群P3_121或P3_221。溶剂含量和自旋函数计算表明，不对称单元中有1个(αβ)_2，与2重轴相关。目前，我们正在利用重原子多重同构取代法进行结构测定。 (2) H蛋白的结构分析：以2.5 Å分辨率进行结构精修。与豆的H蛋白相比，我们发现了一个结构上非常保守的区域。此外，分子表面的静电势保存完好，表明该区域参与与其他组成蛋白的相互作用。