熱帯樹木由来高活性イソプレン合成酵素の探索とハイブリッド型発酵用高機能酵素の開発

寻找源自热带树木的高活性异戊二烯合酶并开发用于混合发酵的高性能酶

• 批准号: 22K05195
• 负责人: 屋 宏典
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: University of the Ryukyus
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05195/
• 关键词: イソプレン; イソプレン合成酵素; クローニング; イソプレン発酵; 酵素機能改変; 熱帯植物; 高機能化

本研究では多様且つイソプレン合成が活発な熱帯植物のイソプレン合成酵素（IspS）を広範囲に探索し、高活性を実現する分子情報を解明し、非石油資源の発酵系に適したハイブリッド型高機能IspSの設計・開発を行うことを目的とする。R4年度は高活性、高基質親和性を可能とするIspSのコンセンサス配列の解明を行う計画であった。一般的に、優良酵素の探索には保存配列を標的にして目的の酵素の遺伝子クローニングを行い、組換え酵素を調製してその性質を解析する方法が用いられる。しかしながら、個々の樹木のIspSについて遺伝子クローニングを行い、組換え酵素の特性を解析する方法は多大の労力と時間を要し、広範な樹種の探索には適していない。これに対し、申請者が開発したPing Pong法は採取した切り枝の温度依存的なイソプレン放出を人工気象室内で測定するもので、わずか1日で温度応答性を評価することができ、極めて短期間で優良なIspSの供給源となる樹種の絞り込みが可能である。今年度はこれまでイソプレン放出測定が行われていない単子葉類に樹種範囲を拡大して、Ping Pong法でIspSの一次スクリーニングを行った。琉球大学構内にある12種の単子葉類のイソプレン放出の温度依存性を調べ、１０種（83％）がイソプレンを放出することを見出した。そのうち、ダンチクが最も高い温度依存性を示したので、IspSの遺伝子クローニングを試みた。IspSのコンセンサス配列を標的にしたRT-PCRにより、ダンチクIspSのコアー配列を得ることができた。ダンチク以外にミツヤヤシが特異な温度応答性を示したので、遺伝子クローニングの候補とした。次年度は、これらの樹種群のIspS遺伝子をクローニングして酵素学的特性を解析し、高機能酵素に特徴的なコンセンサスアミノ酸配列を明らかにする計画である。

在这项研究中，我们在异戊二烯合成中多样化且活跃的热带植物中广泛寻找异戊二烯合酶（IspS），阐明了实现高活性的分子信息，并开发了一种适用于非石油发酵系统的混合高性能IspS目的是设计和开发。在第四年，我们计划阐明 IspS 的共有序列，以实现高活性和高底物亲和力。一般来说，寻找优质酶包括通过靶向保守序列来克隆目标酶的基因、制备重组酶并分析其特性。然而，克隆单株IspS基因并分析重组酶特性的方法需要大量的精力和时间，并且不适合大范围的树种寻找。相比之下，申请人开发的Ping Pong方法在人工气候室中测量收集的插条的温度依赖性异戊二烯释放，并且可以在短短一天内评估温度响应性，使得可以极短地缩小范围。是 IspS 极好的来源的树种。今年，我们扩大了树种范围，将尚未进行异戊二烯释放测量的单子叶植物包括在内，并使用 Ping Pong 方法对 IspS 进行了初步筛选。我们调查了琉球大学校园内12种单子叶植物中异戊二烯释放的温度依赖性，发现10种（83%）释放异戊二烯。其中，Danchik表现出最高的温度依赖性，因此我们尝试克隆IspS基因。通过针对IspS共有序列的RT-PCR，我们能够获得Danchik IspS的核心序列。除丹竹外，三谷棕榈也表现出独特的温度响应性，因此被选为基因克隆的候选者。明年，我们计划克隆这些树种的IspS基因，分析它们的酶学特性，并揭示高功能酶的共有氨基酸序列特征。

项目成果

Molecular characteristics of isoprene synthase and its control effects on isoprene emissions from tropical trees

异戊二烯合酶的分子特征及其对热带树木异戊二烯排放的控制作用

• DOI: 10.1007/s10265-022-01418-4
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 2.8
• 作者: Oku Hirosuke;Mut;a Ishmael;Inafuku Masashi
• 通讯作者: Inafuku Masashi

Non-enzymatic formation of isoprene and 2-methyl-3-buten-2-ol (2-MBO) by manganese

锰非酶促形成异戊二烯和 2-甲基-3-丁烯-2-醇 (2-MBO)

• DOI: 10.1038/s41598-022-06520-0
• 发表时间: 2022-02-14
• 影响因子: 4.6
• 作者: Oku H;Mutanda I;Fukuta M;Inafuku M
• 通讯作者: Inafuku M