液-液相分離により形成される新規細胞内区画の探索

探索液-液相分离形成的新细胞内区室

基本信息

批准号：
21K19205
负责人：
鈴木邦律
金额：
$ 4.16万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

当研究室では共同研究を通じて、選択的オートファジーの基質である、Ape1複合体が液-液相分離により形成される構造体であることを示した（Yamasaki etal., Mol. Cell, 2020）。また我々は最近になって、Ape1にGFPを融合することで高温培養条件下の液-液相分離が阻害され、Ape1複合体形成が不能となる現象を見いだした。本研究課題では、GFPを融合するとタンパク質の活性が温度感受性になる現象が他のタンパク質にも適用可能であることを調べることを目的としている。出芽酵母の生育に必須な遺伝子を破壊すると致死となる。こうした遺伝子は“必須遺伝子”と呼ばれる。上述のように、同様に必須遺伝子にコードされたタンパク質にGFPを融合すると、高温条件下で相分離が起こらなくなり、活性を失う、つまり致死となる可能性を想定した。出芽酵母では、各遺伝子がコードするタンパク質のC末端にGFPを融合した4,100種類余りの株のコレクションが存在する。初年度の研究では、これらの株を寒天培地にて培養し、高温で生育が悪くなる株をスクリーニングした。初年度の研究で、4,100種類の株の一次スクリーニングが終了し、556種類の株が高温感受性の生育を示すことが明らかとなった。本年度はスポッティングアッセイによる二次スクリーニングを終了し、119株が強い表現型を示し、162株が弱い表現型を示すことが明らかとなった。現在強い表現型を示す株を用いて温度変化によるタンパク質の局在変化を蛍光顕微鏡を用いて調べている。

通过合作研究，我们实验室表明，选择性自噬的底物Ape1复合物是通过液-液相分离形成的结构（Yamasaki etal., Mol. Cell, 2020）。我们最近还发现，GFP 与 Ape1 的融合会抑制高温培养条件下的液-液相分离，从而使 Ape1 复合物无法形成。该研究项目的目的是研究与 GFP 融合时蛋白质活性变得温度敏感的现象是否可以应用于其他蛋白质。破坏酿酒酵母生长所必需的基因就会致命。这些基因被称为“必需基因”。如上所述，我们假设如果 GFP 与必需基因编码的蛋白质类似地融合，则在高温条件下不会发生相分离，从而导致活性丧失或致死。在酿酒酵母中，有超过 4,100 个菌株，其中每个基因都编码一种蛋白质，其 C 末端融合有 GFP。在第一年的研究中，这些菌株在琼脂培养基上培养，筛选出在高温下生长不良的菌株。第一年的研究就完成了4100株菌株的初步筛选，发现556株菌株表现出高温敏感生长。今年，我们通过点滴试验完成了二次筛选，发现119株菌株表现出强表型，162株菌株表现出弱表型。我们目前正在使用一种表现出强烈表型的菌株，通过荧光显微镜研究由于温度变化引起的蛋白质定位变化。