冷凍保存可能な花粉を活用した新奇ゲノム編集技術の開発

利用冷冻花粉开发新型基因组编辑技术

基本信息

批准号：
21K19115
负责人：
吉田健太郎
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

パールミレットは、多くの穂を作り、それぞの穂から大量の花粉を取ることができる。さらに、花粉は、乾燥・凍結耐性能をもち、-80度で保存することができる。また、ムギ類との亜科間交雑をした場合、パールミレットの染色体が選択的に脱落することから、ムギ類の倍加半数体を作成することも可能である。本研究では、パールミレットのこの特性を活かし、亜科間交雑による染色体脱落現象を利用した倍加半数体技術とゲノム編集技術を融合し形質転換体の作出が困難なコムギでゲノム編集を1世代で可能にする新しい技術を開発することを目的とする。本年度は、アグロバクテリウムを利用したパールミレットの安定形質転換技術の確立を試みた。MS培地におけるスクロース、カルス化を誘導する2,4-Dの濃度を調節することにより、未熟種子だけでなく、完熟種子からでも再分化能を持つ白いカルスを得ることができることを確認した。また、カルスへのアグロバクテリウム形質転換を試みた。緑色蛍光タンパク質GFP遺伝子の導入によって、カルスの一部にGFP蛍光を検出した。しかし、まだパールミレットの安定形質転換を作出するには至っていない。安定形質転換を用いずに、直接、花粉にゲノム編集に必要なタンパク質（CAS9）と核酸（gRNA）を導入する試験もした。まず、花粉の卵細胞へのデリバリー試薬を検討した。その結果、パールミレットの花粉は、有機溶媒や、リポフェクション試薬に耐性があり、試薬中に花粉管を伸長することができることを確認した。

珍珠粟产生许多穗，每个穗可以收集大量的花粉。此外，花粉具有耐干燥和冷冻的能力，可以在-80摄氏度下保存。此外，当与小麦品种杂交时，珍珠粟的染色体被选择性脱落，从而有可能产生小麦品种的双单倍体。本研究将利用珍珠粟的这一特性，将利用亚科间杂交引起的染色体脱落现象的加倍单倍体技术与基因组编辑技术相结合，对小麦进行一代基因组编辑，从而实现小麦基因组编辑。创造转化体是很困难的，目的是开发使其成为可能的新技术。今年，我们尝试利用农杆菌建立珍珠粟的稳定转化技术。通过调节MS培养基中诱导愈伤组织形成的蔗糖和2,4-D的浓度，证实不仅可以从未成熟的种子中获得具有再生能力的白色愈伤组织，而且可以从成熟的种子中获得。我们还尝试将农杆菌转化为愈伤组织。通过导入绿色荧光蛋白GFP基因，在部分愈伤组织中检测到了GFP荧光。但珍珠粟的稳定转型尚未实现。我们还进行了一项测试，其中将基因组编辑所需的蛋白质（CAS9）和核酸（gRNA）直接引入花粉中，而不使用稳定转化。首先，我们研究了将花粉输送到卵细胞的试剂。结果证实，珍珠粟花粉对有机溶剂和脂转染试剂具有抗性，花粉管在试剂中可以伸长。