均一糖鎖含有バイオ医薬品をワンステップで合成する技術による最適糖鎖構造の探索

利用技术寻找最佳聚糖结构，一步合成均质含聚糖生物药物

基本信息

批准号：
21K19090
负责人：
竹川薫
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

治療用抗体として利用されているIgGタンパクのFc領域にはN-結合型糖鎖が存在しており、その糖鎖に付加するフコース残基の除去がエフェクター機能を増加させることが知られている。そこで本研究では均一な糖鎖構造を有する糖タンパク質を酵素合成するために、糖タンパク質糖鎖の脱フコシル化に必要な1,6-α-L- フコシダーゼとエンドグリコシダーゼ(ENGase)を担体に固定化して、効率的に脱フコシル化を行う技術について検討を行った。本研究ではビフィズス菌由来のフコシダーゼと、フコース含有糖鎖を切断可能なENGaseである冬虫夏草由来Endo-CoMを用いた。両酵素をそれぞれNHS-Activated Agarose とCyanogen bromide-activated Sepharoseに固定化を行った。条件を検討したところ、両酵素ともNHS-Activated Agaroseに固定化後も活性を保持することが確認することができた。特にNHS-Activated Agaroseに固定化したフコシダーゼでは42%の活性を保持していた。さらに、両固定化酵素を用いてN-結合型糖鎖の脱フコシル化後のIgGについてLC/MSで測定を行ったところ、脱フコシル化された糖鎖が確認できた。ヒト由来の糖タンパク質には、3本鎖や4本鎖の多分岐の糖鎖を持つものも報告されている。そのような糖鎖の脱糖鎖と糖転移を可能にするために新たなエンドグリコシダーゼの検索を試みた。その結果、腸内細菌の一種であるBacteroides nordiiのゲノムに存在するエンドグリコシダーゼが多分岐糖鎖を切断する新規な特異性を有する酵素であることを明らかにできた。今後はこれらの酵素も固定化を試みて、糖タンパク質糖鎖部分のすげ替えに有効なシステムの検討を行いたい。

N-连接糖链存在于用作治疗性抗体的 IgG 蛋白的 Fc 区中，并且已知去除附着在这些糖链上的岩藻糖残基会增强效应子功能。因此，在本研究中，为了酶法合成具有均匀糖链结构的糖蛋白，我们将糖蛋白糖链去岩藻糖基化所必需的1,6-α-L-岩藻糖苷酶和糖苷内切酶（ENGase）固定在载体上。我们研究了有效去岩藻糖基化的技术。在这项研究中，我们使用了源自双歧杆菌的岩藻糖苷酶和源自冬虫夏草的 Endo-CoM，这是一种可以裂解含岩藻糖糖链的 ENGase。两种酶分别固定在 NHS 激活的琼脂糖和溴化氰激活的琼脂糖上。检查条件后，证实这两种酶即使固定在 NHS 活化琼脂糖上后仍保留其活性。特别是，固定在 NHS 激活琼脂糖上的岩藻糖苷酶保留了 42% 的活性。此外，当使用两种固定化酶将N-连接糖链去岩藻糖基化后通过LC/MS测量IgG时，证实了去岩藻糖基化的糖链。据报道，一些人源糖蛋白具有三链和四链超支化糖链。我们试图寻找一种新的糖苷内切酶来实现糖链的去糖基化和转糖基化。结果表明，诺氏拟杆菌（一种肠杆菌）基因组中存在的糖苷内切酶是一种具有新的特异性裂解多支链糖链的酶。未来，我们也想尝试将这些酶固定化，并研究一种有效取代糖蛋白糖链部分的系统。