Development of novel drug screening system for neuroblastoma by elucidating the transcriptional activation mechanism of glycosyltransferase

阐明糖基转移酶转录激活机制，开发神经母细胞瘤新药筛选系统

基本信息

批准号：
22K06593
负责人：
佐藤武史
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

令和4年度は研究実施計画に基づいて、神経芽腫の悪性形質に関わるβ4-ガラクトース転移酵素 (β4GalT) 3の転写因子N-Mycによる転写活性化の分子メカニズムの解析を実施した。定量的RT-PCRによって、N-MycのmRNA発現はSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫ではA549ヒト肺癌細胞に比べて12倍高いことが示された。そのため共導入実験ではN-Mycの効果がより顕著に現れることを期待して、N-Mycの発現が低いA549細胞を使用することとした。初めに、β4GalT3遺伝子の5’-上流領域に存在する3箇所のN-Myc結合部位のうち、N-Mycによるβ4GalT3の転写活性化には-1148/-1143のN-Myc結合部位が関わっていることを特定した。次に、β4GalT3の転写を制御する転写因子Sp3とN-Mycの相互関係を明らかにするために、Sp3結合部位 (-39/-30と-19/-10) に変異を導入したレポータープラスミドとN-Myc発現プラスミドを共導入することで、N-Mycによるβ4GalT3プロモーターの活性化の有無を解析した。その結果、Sp3結合部位に変異を導入すると、N-Mycを共導入してもプロモーター活性は増加しなかった。従って、N-MycがSp3と共同してβ4GalT3の転写を活性化することが初めて明らかにされた。さらに、β4GalT3の転写活性化にSp3とN-Mycがどのような分子メカニズムで関与するかを明らかにするために、Sp3とN-Mycの相互作用を解析した。SH-SY5Y細胞から調製した核抽出物を試料として抗Sp3抗体を用いた共免疫沈降を行ない、ウエスタンブロット解析によりSp3とN-Mycを検出した。その結果、共免疫沈降物中にSp3が検出されたが、N-Mycは検出されなかった。従って、Sp3とN-Mycは直接相互作用していない可能性が示唆された。

2020财年，根据研究实施计划，我们分析了转录因子N-Myc转录激活β4-半乳糖基转移酶（β4GalT）3参与神经母细胞瘤恶性特征的分子机制。定量 RT-PCR 显示，SH-SY5Y 人神经母细胞瘤中的 N-Myc mRNA 表达量比 A549 人肺癌细胞高 12 倍。因此，在共导入实验中，我们决定使用低表达N-Myc的A549细胞，希望N-Myc的效果更加明显。首先，存在于β4GalT3基因5'上游区域的3个N-Myc结合位点中，位于-1148/-1143的N-Myc结合位点参与N-Myc对β4GalT3的转录激活。确定有。接下来，为了阐明控制 β4GalT3 转录的转录因子 Sp3 和 N-Myc 之间的相互作用，我们使用了在 Sp3 结合位点（-39/-30 和 -19/-10）中引入突变的报告质粒通过共同引入N-Myc表达质粒，我们分析了N-Myc对β4GalT3启动子的激活。结果，当将突变引入Sp3结合位点时，即使共同引入N-Myc，启动子活性也不会增加。因此，首次揭示了N-Myc与Sp3协同激活β4GalT3转录。此外，为了阐明Sp3和N-Myc参与β4GalT3转录激活的分子机制，我们分析了Sp3和N-Myc之间的相互作用。使用从SH-SY5Y细胞制备的核提取物作为样品，使用抗Sp3抗体进行免疫共沉淀，并通过蛋白质印迹分析检测Sp3和N-Myc。结果，在免疫共沉淀物中检测到Sp3，但未检测到N-Myc。因此，有人认为Sp3和N-Myc可能不会直接相互作用。