リボソーム融合型ナノポア技術による１分子タンパク質網羅定量解析

利用核糖体融合纳米孔技术对单分子蛋白质进行全面定量分析

• 批准号: 21K18232
• 负责人: 上村 想太郎
• 金额: $ 16.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K18232/
• 关键词: ナノポア; 脂質膜; ペプチド; １分子; タンパク質翻訳; リボソーム; 膜タンパク質

当該年度においては、ペプチドの１分子ナノポア計測実現を目指し、平面膜上での脂質膜再構成とSecYEGチャネルタンパク質の挿入、及びSecAタンパク質との複合体に対する基質ペプチドの膜通過シグナルの検出を試みた。4つのチャネルを同時計測可能なナニオンテクノロジーズ社のOrbit miniと温度コントローラーを導入し、温度条件を変えながら脂質膜の構築を試した。脂質膜は多重膜にならず、脂質二重膜の単重膜が形成される条件を決めることができた。さらに、SecYEGが膜に挿入されることを印加電圧を可変にした電流応答の変化で複数回確認できたが、導入効率は低いままであったため、ペプチド通過計測には至らなかった。次年度においては、これらを改善するために、PURE systemを用いた無細胞合成系によるSecYEG挿入や脂質膜の組み合わせの改良、さらには平面膜のみならず、液滴接触法を用いて実験系の改良を試みる。これによってペプチドの通過信号を得ることができたら、複数種類のペプチドの通過データをいくつかの印加電圧で取得し、それらに対して機械学習による解析を行う。その後、複数種類のペプチドを分類することを通過電流データのみで行うことを目標とする。さらには、リボソーム分子とSecYEGとの融合を試み、合成過程と新生ペプチドの通過過程の同時測定を試みる。このために、シグナル配列の検討、温度条件検討、及びイオン強度条件検討が必須となる。

本财年，以实现肽的单分子纳米孔测量为目标，我们尝试在平面膜上重建脂质膜，插入SecYEG通道蛋白，并检测与SecA蛋白复合的底物肽的过膜信号。我们安装了 Nanion Technologies 的 Orbit mini（可以同时测量四个通道）和温度控制器，并尝试在改变温度条件的同时构建脂质膜。我们能够确定脂质膜不形成多层膜而形成单个脂质双层膜的条件。此外，虽然我们能够通过改变施加电压来改变电流响应来多次确认SecYEG被插入膜中，但由于引入效率仍然很低，我们无法测量肽的通过。在下一个财政年度，为了改善这些问题，我们将通过使用PURE系统和脂质膜组合的无细胞合成系统来改进SecYEG的插入。一旦由此获得肽转运信号，就可以在多个施加电压下获取多种类型肽的转运数据，并使用机器学习进行分析。之后，目标是仅使用传递的当前数据对多种类型的肽进行分类。此外，我们将尝试将核糖体分子与SecYEG融合，并同时测量新生肽的合成过程和传代过程。为此，必须检查信号序列、温度条件和离子强度条件。

项目成果

Development of a single-particle inclusions detection method by solid-state nanopore for miRNA in single exosome detection

开发用于单外泌体检测中 miRNA 的固态纳米孔单颗粒包含物检测方法

• 发表时间: 2022
• 作者: Takumi Uchida; Hirohito Yamazaki; Ryo Iizuka; Sotaro Uemura
• 通讯作者: Sotaro Uemura

レーザー照射による固液界面でのリポソームの捕捉と破壊

激光照射在固液界面捕获和破坏脂质体

• 发表时间: 2021
• 作者: 内田匠;山崎洋人;上村想太郎
• 通讯作者: 上村想太郎

Upregulation of IL-4 receptor signaling pathway in circulating ILC2s from asthma patients

哮喘患者循环 ILC2 中 IL-4 受体信号通路的上调

• DOI: 10.1016/j.jacig.2022.07.007
• 发表时间: 2022
• 作者: Baba Rie;Kabata Hiroki;Shirasaki Yoshitaka;Kamatani Takashi;Yamagishi Mai;Irie Misato;Watanabe Risa;Matsusaka Masako;Masaki Katsunori;Miyata Jun;Moro Kazuyo;Uemura Sotaro;Fukunaga Koichi
• 通讯作者: Fukunaga Koichi

A study on the structural dynamics of the nucleosome containing H2A.B using solid-state nanopores

利用固态纳米孔研究含有H2A.B的核小体的结构动力学

• 发表时间: 2022
• 作者: Hikaru Nozawa; Hirohito Yamazaki; Ryo Iizuka; Rina Hirano; Tomoya Kujirai; Hitoshi Kurumizaka; Sotaro Uemura
• 通讯作者: Sotaro Uemura

Photothermally enhanced single molecule nanopore sensing

光热增强单分子纳米孔传感

• 发表时间: 2021
• 作者: Hirohito Yamazaki; Sotaro Uemura
• 通讯作者: Sotaro Uemura