Elucidation of mechanical property and self-repair mechanism of microtubule with high-speed AFM

用高速原子力显微镜阐明微管的机械性能和自我修复机制

基本信息

批准号：
17F17701
负责人：
内橋貴之
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

I. インラインフォースカーブモードの開発：高速AFMでタンパク質の動態を可視化しながら、任意の位置で試料の力学操作と機械特性計測が可能なインラインフォースカーブモードを開発した。具体的には、イメージング中にPCに表示された画像で決めた位置で画像取得を停止し、プローブ-試料間距離を変化させてフォースカーブを取得し、引き続きイメージングを行い局所外力印加後の分子の動態を観察できるシステムを構築した。これにより微小管への局所外力の印加とそれによる構造変化やナノ力学特性の定量的解析が可能になった。II.　微小管への欠陥生成と機械特性評価：インラインフォースカーブモードを使って、微小管からチューブリンダイマーを引き抜き、同時にフォースカーブを計測することに成功した。さらに、欠陥のサイズを変えながらフォースカーブを取得し、チューブリン間の結合力を定量化した。これにより、これまで理論的にしか研究されていなかった微小管の機械特性を解析することができた。III. 微小管の自己修復過程の可視化：微小管にチューブリンダイマーの欠陥を形成後、その欠陥が再びチューブリンの再結合による修復される、自己修復と呼ばれる現象を捉えることに成功した。この測定により、微小管の自己修復過程は微小管の中空内で拡散しているチューブリンの結合で生じることを明らかにした。IV. 欠陥周囲のキネシンの運動解析：微小管の構造欠陥周辺でのキネシンの運動観察を行った。微小管に沿って進んできたキネシンが欠陥直前で微小管から解離したり、プロトフィラメントを乗り換えて、欠陥を迂回して進んでいく様子が見られた。さらに再現性の高い実験を可能にするため、多数の微小管を平行に並べてストライプ状に配列させる基板条件の検討を行った。その結果、適切なバッファ条件と基板に脂質二重膜を用いることで微小管をストライプ状に整列させることに成功した。

I. 内联力曲线模式的开发：我们开发了内联力曲线模式，允许在任何位置对样品进行机械操作和机械性能测量，同时使用高速 AFM 可视化蛋白质动力学。具体来说，在成像过程中，在PC上显示的图像确定的位置处停止图像采集，改变探针与样品的距离以获取力曲线，并在施加局部外力后继续成像以检测分子。系统可以让我们观察动态这使得对微管施加局部外力并定量分析由此产生的结构变化和纳米力学特性成为可能。 II.微管缺陷的产生和力学性能的评估：利用内联力曲线模式，我们成功地从微管中拉出微管蛋白二聚体，并同时测量力曲线。此外，在改变缺陷尺寸时获得力曲线，并对微管蛋白之间的结合力进行量化。这使得分析微管的机械性能成为可能，而此前这仅在理论上进行了研究。 III.微管自我修复过程的可视化：我们成功捕获了一种称为自我修复的现象，即微管中形成微管蛋白二聚体的缺陷，然后通过微管蛋白重组进行修复。这些测量表明，微管的自我修复过程是通过微管腔内扩散的微管蛋白的结合发生的。 IV.缺陷周围驱动蛋白运动的分析：我们观察了微管结构缺陷周围驱动蛋白的运动。沿着微管行进的驱动蛋白在缺陷之前与微管分离，或者转换原丝并在缺陷周围行进。为了使实验具有更高的重现性，我们研究了允许许多微管平行排列成条纹的基质条件。结果，他们通过使用适当的缓冲条件和脂质双层膜作为基质，成功地将微管排列成条纹。