High-Speed-AFM Analysis of Structural and Mechanical Properties of Single Protein under Mechanical Stimulation

机械刺激下单一蛋白质的结构和机械特性的高速 AFM 分析

基本信息

批准号：
21H01772
负责人：
内橋貴之
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に開発した一軸伸張機構付き探針走査型高速AFMを用いて、脂質膜の曲率を感知して膜に結合する分子であるBIN1の曲率依存的な膜への結合を観察した。PDMS基板に応力を加えると、基板表面に応力印加方向とは垂直方向に沿って表面リップル構造を曲率を制御して作ることができた。次にBIN1の脂質膜への結合ダイナミクスを観察したところ、平坦な脂質膜へは明らかな結合は確認できなかった。親和性の高いCNM関連変異体K436Xであっても観察できず、BIN1と平板脂質との相互作用はAFM探針からの外乱で容易に解離するほど弱いか、少なくとも結合時間は最速0.1秒/フレームのイメージング速度を用いた高速FMの時間分解能よりはるかに短いことを示している。一方、曲率を持つ脂質膜表面では0.5秒/フレームのイメージング速度でも、BIN1の脂質膜への結合が明確に観察された。ほとんどのBIN1分子は、脂質で覆われたリップル構造の頂上付近で安定に結合し、側面や底面ではあまり結合しておらず、正の曲率領域への優先的な結合が示唆された。異なる曲率での単分子の脂質膜上での滞留時間のヒストグラムを作り、単指数減衰関数でフィッティングしたところ、脂質膜の曲率が5.59μm-1での時定数は1.83±0.09秒、414.27μm-1での時定数は3.77±0.06秒となった。これは、脂質曲率の違いにより親和性に2倍近い差が生じることを示している。これまでの研究では、BIN1と脂質の相互作用は、脂質の曲率の違いによるBIN1の結合による蛍光強度の変化としてしか解析できなかったが、今回開発した一軸伸張機構付き探針走査型高速AFMにより、脂質の曲率に依存した結合・解離のダイナミクスを1分子レベルで直接測定することができるようになった。

使用去年开发的具有单轴延伸机制的探针扫描高速 AFM，我们观察到 BIN1 的曲率依赖性结合，BIN1 是一种感知脂质膜曲率并与膜结合的分子。通过向 PDMS 基底施加应力，我们能够通过控制曲率，沿着垂直于基底表面上应力施加方向的方向创建表面波纹结构。接下来，我们观察了BIN1与脂质膜的结合动力学，发现与平坦的脂质膜没有明显的结合。即使是具有高亲和力的 CNM 相关突变体 K436X 也无法观察到，并且 BIN1 与血小板脂质之间的相互作用非常弱，很容易受到 AFM 尖端的干扰而解离，或者至少结合时间为快至 0.1 秒/帧表明使用成像速度的时间分辨率比快速 FM 短得多。另一方面，在具有曲率的脂质膜表面上，即使在0.5秒/帧的成像速度下也清楚地观察到BIN1与脂质膜的结合。大多数 BIN1 分子稳定地结合在脂质覆盖的波纹结构的顶部附近，而在侧面和底部的结合较少，表明优先结合到正曲率区域。当创建单个分子在不同曲率的脂膜上的停留时间直方图并用单指数衰减函数拟合时，时间常数为1.83±0.09秒，414.27μm-1，当脂膜曲率为5.59μm-1。1处的时间常数为3.77±0.06秒。这表明脂质曲率的差异导致亲和力相差近两倍。在以前的研究中，BIN1 和脂质之间的相互作用只能通过由于脂质曲率差异而导致 BIN1 结合引起的荧光强度变化进行分析，现在可以直接测量脂质曲率依赖性结合和解离动力学。单分子水平。

项目成果

期刊论文数量（29）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Shape-selective one-step synthesis of branched gold nanoparticles on the crystal surface of redox-active PdII-macrocycles

氧化还原活性Pd<sup>II</sup>大环晶体表面择形一步合成支化金纳米粒子

DOI：
10.1039/d1dt03973c
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
4
作者：
Yamashita Yutaro;Tashiro Shohei;Ishii Yoshiki;Uchihashi Takayuki;Matsushita Nobuyuki;Kubota Ryou;Shionoya Mitsuhiko
通讯作者：
Shionoya Mitsuhiko

Protein Needles Designed to Self‐Assemble through Needle Tip Engineering

蛋白质针设计为通过针尖工程自组装

DOI：
10.1002/smll.202106401
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
13.3
作者：
Kikuchi Kosuke;Fukuyama Tatsuya;Uchihashi Takayuki;Furuta Tadaomi;Maeda Yusuke T.;Ueno Takafumi
通讯作者：
Ueno Takafumi

Construction of ferritin hydrogels utilizing subunit_subunit interactions

利用亚基-亚基相互作用构建铁蛋白水凝胶

DOI：
10.1371/journal.pone.0259052
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
3.7
作者：
Yamanaka M;Mashima T;Ogihara M;Okamoto M;Uchihashi T;Hirota S
通讯作者：
Hirota S

3D Structure of Ring-shaped Microtubule Swarms Revealed by High-speed Atomic Force Microscopy

高速原子力显微镜揭示环形微管群的 3D 结构

DOI：
10.1246/cl.220491
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
1.6
作者：
Rashid Mst. Rubaya;Ganser Christian;Akter Mousumi;Nasrin Syeda Rubaiya;Kabir Arif Md. Rashedul;Sada Kazuki;Uchihashi Takayuki;Kakugo Akira
通讯作者：
Kakugo Akira

Clarification of Surface Deswelling of Thermoresponsive Microgels by Electrophoresis

通过电泳澄清热响应性微凝胶的表面消溶胀

DOI：
10.1021/acs.langmuir.2c02742
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
3.9
作者：
Nishizawa Yuichiro;Inui Takumi;Namioka Ryuji;Uchihashi Takayuki;Watanabe Takumi;Suzuki Daisuke
通讯作者：
Suzuki Daisuke