Mechanisms of RNA binding proteins rescuing FUS induced toxicity in yeast

RNA 结合蛋白拯救 FUS 诱导的酵母毒性的机制

• 批准号: 10202952
• 负责人: Shulin Ju
• 金额: $ 45万
• 依托单位: WRIGHT STATE UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2021-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10202952
• 关键词: ALS pathology; Affect; Amyotrophic Lateral Sclerosis; Automobile Driving; Biological Process; C-terminal; C9ORF72; Cells; Collaborations; Color; Cues; Cytosol; DNA; Data; Defect; Development; Disease; Dose; Environment; Eukaryota; Fluorescence; Fluorescence Microscopy; Functional disorder; Gene Library; Genes; Genetic; Genetic Models; Growth; Home; Homologous Gene; Human; Image; Impairment; Individual; Institution; Laboratories; Length; Libraries; Light; Mammalian Cell; Mammals; Mediating; Methods; Modeling; Monitor; Mus; N-terminal; Neurodegenerative Disorders; Neurons; Partner in relationship; Pathologic; Pathway interactions; Point Mutation; Proteins; RNA; RNA Binding; RNA metabolism; RNA-Binding Protein FUS; RNA-Binding Proteins; Rattus; Regulation; Research; Resources; Ribonucleoproteins; Role; Stress; Structure; Suppressor Genes; TAF15 gene; Testing; Toxic effect; Two-Hybrid System Techniques; Western Blotting; Work; Yeast Model System; Yeasts; base; cytotoxicity; experimental study; expression vector; fitness; gene cloning; genome-wide; insight; interest; live cell imaging; mutant; new therapeutic target; novel; novel therapeutics; overexpression; protein TDP-43; protein aggregation; protein biomarkers; response; screening; stress granule; success; therapeutically effective; tool; undergraduate student

PROJECT SUMMARY  Identification of two RNA-­binding proteins (RBPs), FUS and TDP-­43, as causative factors of Amyotrophic  Lateral Sclerosis (ALS) resulted in a paradigm shift centered on RNA dysfunction as a disease-­driving  mechanism. We previously established a yeast model of FUS cytotoxicity. Using this model, we carried out  genome-­wide overexpression screen and identified five yeast genes that rescue FUS toxicity. Three out of  five suppressor genes have human homologs and all three encode RBPs. We found that hUPF1, the  human homolog of one of the three RBPs, rescues the toxicity of FUS in mouse primary neurons and a rat  model of ALS. These findings support the value of our study of FUS toxicity in yeast and uncovered a novel  pathway, currently under development as new therapeutics for ALS. Motivated by this success, we  constructed a new genome-­scale library, containing 13,570 full-­length sequence verified human gene  clones individually cloned in an inducible yeast-­expression vector. Using this library and a newly developed  efficient screening method, we identified 37 human genes, when overexpressed, robustly rescuing FUS  induced toxicity in yeast. Genes encoding RBPs are highly enriched among suppressors (12 out of 37).  Strikingly, all 12 RBP suppressors have known connections to stress granules (SG). The objective of this  application is to define mechanisms of FUS toxicity by studying how the 12 RBPs work to rescue cellular  defects induced by FUS. We hypothesize that toxicity of FUS involves direct impairment of SG function,  and human RBP suppressors rescue FUS toxicity by alleviating detrimental effect of FUS on SG. Two  specific Aims are proposed: i) examine the effect of suppressor RBPs on FUS aggregation and localization;;  and ii) examine the effects of suppressor RBPs on SG. Our hypothesis is consistent with findings that FUS  protein aggregates mis-­localize to SG in yeast and in mammalian cells. Based on our preliminary data on  TAF15, one of the human RBP suppressors, we reason that the suppressor mechanisms likely involve  interactions between FUS and the suppressors as well as alterations in SG structure and function.  Regulation and mis-­regulation of SG is a pathway that is of immense interest to ALS research field.  Completion of this project will provide deeper understanding of FUS mediated cytotoxicity, its connection to  RNA metabolism, particularly with respect to aberrant SG function. Projects proposed here will not only  expose more undergraduate students to meritorious research in the PI’s laboratory but also help promote  discussion on scientific discoveries in an upper lever undergraduate course, regularly offered by the PI.  Both serve to strengthen the research environment at the PI’s home institution.

项目摘要 将两种RNA结合蛋白（RBP），FUS和TDP-43鉴定为肌萎缩症的致病因子 侧硬化症（ALS）导致范式偏移以RNA功能障碍为中心 机制。我们以前建立了酵母菌细胞毒性的酵母模型。使用此模型，我们执行 全基因组的过表达筛查，并确定了五个挽救FUS毒性的酵母基因。三个 五个抑制基因具有人类同源物，所有三个抑制基因都编码RBP。我们发现Hupf1， 三个RBP之一的人类同源物营救了小鼠原发性神经元和大鼠的FUS毒性 ALS的模型。这些发现支持了我们研究酵母中FUS毒性的价值，并发现了一种新颖 途径，目前正在开发为ALS的新疗法。受这一成功的动机，我们 构建了一个新的基因组规模库，其中包含13,570个全长序列验证的人类基因 克隆单独克隆在诱导的酵母表达载体中。使用此库和新开发的 有效的筛选方法，我们确定了37个人类基因，当过表达稳健的FUS时 诱导酵母的毒性。编码RBP的基因在补充剂中高度丰富（37分中的12个）。 令人惊讶的是，所有12个RBP倡导者都已经知道与应力颗粒（SG）的联系。这个目的 应用是通过研究12个RBP的工作方式来定义FUS毒性的机制 FUS引起的缺陷。我们假设FUS的毒性涉及直接损害SG功能， 人类RBP通过减轻FUS对SG的有害影响来挽救FUS毒性。二 提出了具体目的：i）检查抑制RBP对FUS聚集和定位的影响； ii）检查抑制RBP对SG的影响。我们的假设与FUS的发现一致 蛋白质聚集在酵母和哺乳动物细胞中的SG散布。根据我们的初步数据 TAF15是人类RBP超级服务器之一，我们认为抑制机制可能涉及 FUS与供应商之间的相互作用以及SG结构和功能的改变。 SG的调节和错误调节是ALS研究领域引起极大兴趣的途径。 该项目的完成将为FUS介导的细胞毒性提供更深入的了解，其联系 RNA代谢，特别是关于异常SG功能的代谢。这里提出的项目不仅将 将更多的本科生暴露于PI实验室中的功绩研究，但也有助于促进 关于PI经常提供的上杠杆本科课程中科学发现的讨论。 两者都在加强PI家庭机构的研究环境。