Modeling esophageal/respiratory birth defects in human pluripotent stem cell (PSC)-derived fetal tissues

在人类多能干细胞 (PSC) 衍生的胎儿组织中模拟食管/呼吸系统出生缺陷

• 批准号: 10174986
• 负责人: James M Wells
• 金额: $ 32.3万
• 依托单位: CINCINNATI CHILDRENS HOSP MED CTR
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2017-08-15 至 2022-05-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10174986
• 关键词: Achalasia; Affect; Autologous; Barrett Esophagus; Biochemical; Biological Assay; Biological Models; Cell Line; ChIP-seq; Collaborations; Colon; Complex; Congenital Abnormality; Defect; Development; Disease; Dominant-Negative Mutation; Dorsal; Embryo; Endoderm; Enteric Nervous System; Eosinophilic Esophagitis; Epithelial; Esophageal Atresia; Esophageal Tissue; Esophagus; Failure; Fetal Tissues; Food; Gastroesophageal reflux disease; Genes; Genetic Transcription; Germ Layers; HMG-Box Domains; Human; Human Characteristics; Impairment; Lead; Malignant neoplasm of esophagus; Megaesophagus; Modeling; Molecular; Morphogenesis; Morphology; Movement; Mus; Muscle; Mutation; Operative Surgical Procedures; Oral cavity; Organoids; Pathology; Pathway interactions; Patients; Physiological; Pluripotent Stem Cells; Primitive foregut structure; Process; Regulator Genes; Reporter; Resort; Respiratory System; Role; Signal Transduction; Smooth Muscle; Stomach; Stratified Epithelium; Surgeon; Tissue Engineering; Tissues; Trachea; Tracheoesophageal Fistula; Transcriptional Activation; Tube; base; beta catenin; cell motility; cell type; constriction; embryo tissue; human pluripotent stem cell; human tissue; induced pluripotent stem cell; loss of function; molecular modeling; motility disorder; nerve supply; nervous system development; novel; protein B; protein protein interaction; reconstruction; respiratory; segregation; stem cell based approach; tissue reconstruction; transcription factor; transcriptome sequencing; vertebrate embryos

Summary: Modeling EA/TEF In Human PSC-­Derived Embryonic Tissues      During  development  of  the  vertebrate  embryo,  a  common  foregut  tube  gives  rise  to  the  esophagus  and  respiratory  tract  and  this  involves  an  array  of  complex  molecular  and  morphological  processes.  The  dorsal  foregut tube forms the esophagus and the ventral domain forms the respiratory tract, and failure to do so can  result in tracheaesophageal birth defects such as esophageal atresia and tracheoesophageal fistula (EA/TEF).  As  discussed  in  project  2,  much  is  known  about  how  Wnt  and  BMP  signaling  promote  a  respiratory  fate  by  activation  of  the  transcription  factor  Nkx2.1.  In  contrast,  little  is  known  about  pro-­esophageal  factors.  Mouse  and  human  studies  demonstrate  that  the  HMG-­box  transcription  factor  Sox2  is  involved  in  segregation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages,  however  whether  Sox2  promotes  an  esophageal  fate  or  acts  predominantly to repress respiratory-­inducing pathways the dorsal foregut is unclear. We hypothesize that both  mechanisms are involved in normal esophageal development.    In  humans,  most  genes  that  cause  EA/TEF  remain  unidentified.  However,  heterozygous  mutations  in  SOX2  can  cause  of  EA  and  TEF,  which  is  in  contrast  to  mice  with  heterozygous  loss  of  Sox2,  which  are  normal.  Complete loss of Sox2 from the foregut endoderm of mouse embryos results in esophageal agenesis, however  Sox2 is also expressed during development of the enteric nervous system (ENS) of the esophagus. Given that  patients  with  EA  can  have  motility  defects,  we  hypothesize  some  EA-­associated  genes  may  affect  ENS  development. However, a study of how EA-­associated mutations differentially affect the epithelium and/or ENS  of  the  esophagus  has  never  been  done  in  any  species,  let  alone  humans.  We  propose  several  novel  PSC-­ based approaches to study how Sox2 and other EA-­associated genes impact Human esophagus specification,  epithelial  morphogenesis,  and  functional  innervation  using  human  pluripotent  stem  cell-­derived  esophageal  organoids with an enteric nervous system.      In  this  project  we  aim  to  identify  the  mechanisms  underlying  esophageal  specification  and  development in humans by first focusing on the key esophageal factor Sox2. We hypothesize that SOX2  acts  both  to  repress  the  respiratory  lineage,  and  promote  an  esophageal  fate  via  an  unidentified  gene  regulatory network. We will use a human PSC-­derived foregut model in combination with SOX2 gain-­ and loss-­ of-­function  to  identify  a  respiratory  GRN  that  is  repressed  by  SOX2  and  an  esophageal  GRN  that  is  SOX2-­ dependant. Conversely we will determine if NKX2.1 represses the esophageal fate. We will take advantage of  the expandable nature of human foregut cultures to identify direct transcriptional targets of human SOX2 and  NKX2.1 using RNA-­seq and ChIP-­seq. We will then investigate the disease mechanisms underlying TEF  and EA that are caused by Sox2 mutations. We will generate PSC lines harboring patient-­based mutations in  SOX2  and  investigate  how  these  impact  the  formation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages.  We  will  identify  the  impact  of  SOX2  mutations  on  Wnt  and  BMP  signaling  and  if  Sox2  acts  by  direct  protein-­protein  interactions  with  the  effector  proteins  b-­catenin/TCF  and  Smads.  Lastly  we  will  investigate  how  EA  mutations differentially effect the different cell types of the esophagus;; the epithelial, smooth muscle  and  ENS.  Given  that  some  patients  with  EA  have  associated  motility  disorders  including  achalasia  3,  constrictions 4 and megaesophagus 5, we will investigate if Sox2 mutations also have ENS deficits. We will use  iPSC  lines  derived  from  EA/TEF  patients  identified  in  projects  1  and  2  to  model  the  molecular  deficits  underlying this birth defect using our human PSC-­derived organoid model.

摘要：在人类 PSC 衍生的胚胎组织中模拟 EA/TEF     在脊椎动物胚胎的发育过程中，共同的前肠管产生食道和 呼吸道，这涉及一系列复杂的分子和形态过程。 前肠管形成食道，腹侧区域形成呼吸道，如果不这样做，可能会 导致气管食管出生缺陷，例如食管闭锁和气管食管瘘（EA/TEF）。 正如项目 2 中所讨论的，人们对 Wnt 和 BMP 信号如何通过以下方式促进呼吸命运有很多了解： 相比之下，我们对小鼠食管因子的激活知之甚少。 和人类研究表明，HMG-box 转录因子 Sox2 参与了 食管和呼吸道谱系，然而 Sox2 是否促进食管命运或发挥作用 背侧前肠主要抑制呼吸诱导途径尚不清楚。 机制参与正常食管发育。   在人类中，大多数导致 EA/TEF 的基因仍未确定，但是 SOX2 的杂合突变。 可能会导致 EA 和 TEF，这与 Sox2 杂合缺失的小鼠相反，后者是正常的。 然而，小鼠胚胎前肠内胚层中 Sox2 的完全缺失会导致食管发育不全 Sox2 也在食道肠神经系统 (ENS) 发育过程中表达。 EA 患者可能会影响运动缺陷，我们捕获了一些 EA 相关基因可能会影响 ENS 然而，一项关于 EA 相关突变如何不同地影响上皮和/或 ENS 的研究。 食道的研究从未在任何物种中进行过，更不用说人类了。 基于方法来研究 Sox2 和其他 EA 相关基因如何影响人类食道规格， 使用人多能干细胞来源的食管上皮形态发生和功能神经支配 具有肠神经系统的类器官。   在这个项目中，我们的目标是确定食管规范的潜在机制和 首先关注关键的食管因子 Sox2，我们假设 SOX2。 既能抑制呼吸谱系，又能通过未知基因促进食管命运 我们将使用源自人类 PSC 的预测模型与 SOX2 收益和损失相结合。 功能失调以识别受 SOX2 抑制的呼吸 GRN 和 SOX2- 的食道 GRN 相反，我们将确定 NKX2.1 是否会抑制食管命运。 人类前肠培养物的可扩展性，用于识别人类 SOX2 的直接转录靶标 使用 RNA-seq 和 ChIP-seq 的 NKX2.1 然后我们将研究 TEF 的疾病机制。 和由 Sox2 突变引起的 EA，我们将生成含有基于患者的突变的 PSC 系。 SOX2 以及它们如何影响食管和呼吸道谱系的形成。 确定 SOX2 突变对 Wnt 和 BMP 信号传导的影响以及 Sox2 是否通过直接蛋白质-蛋白质发挥作用 最后我们将研究 EA 与效应蛋白 b-catenin/TCF 和 Smads 的相互作用。 突变对食管的不同细胞类型有不同的影响； 鉴于一些 EA 患者存在相关运动障碍，包括贲门失弛缓症 3， 狭窄 4 和巨食管 5，我们将研究 Sox2 突变是否也有 ENS 缺陷。 源自项目 1 和项目 2 中鉴定的 EA/TEF 患者的 iPSC 系，用于模拟分子缺陷 使用我们的人类 PSC 衍生类器官模型来揭示这种先天缺陷。