Modeling esophageal/respiratory birth defects in human pluripotent stem cell (PSC)-derived fetal tissues

在人类多能干细胞 (PSC) 衍生的胎儿组织中模拟食管/呼吸系统出生缺陷

• 批准号: 10174986
• 负责人: James M Wells
• 金额: $ 32.3万
• 依托单位: CINCINNATI CHILDRENS HOSP MED CTR
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2017-08-15 至 2022-05-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10174986
• 关键词: Achalasia; Affect; Autologous; Barrett Esophagus; Biochemical; Biological Assay; Biological Models; Cell Line; ChIP-seq; Collaborations; Colon; Complex; Congenital Abnormality; Defect; Development; Disease; Dominant-Negative Mutation; Dorsal; Embryo; Endoderm; Enteric Nervous System; Eosinophilic Esophagitis; Epithelial; Esophageal Atresia; Esophageal Tissue; Esophagus; Failure; Fetal Tissues; Food; Gastroesophageal reflux disease; Genes; Genetic Transcription; Germ Layers; HMG-Box Domains; Human; Human Characteristics; Impairment; Lead; Malignant neoplasm of esophagus; Megaesophagus; Modeling; Molecular; Morphogenesis; Morphology; Movement; Mus; Muscle; Mutation; Operative Surgical Procedures; Oral cavity; Organoids; Pathology; Pathway interactions; Patients; Physiological; Pluripotent Stem Cells; Primitive foregut structure; Process; Regulator Genes; Reporter; Resort; Respiratory System; Role; Signal Transduction; Smooth Muscle; Stomach; Stratified Epithelium; Surgeon; Tissue Engineering; Tissues; Trachea; Tracheoesophageal Fistula; Transcriptional Activation; Tube; base; beta catenin; cell motility; cell type; constriction; embryo tissue; human pluripotent stem cell; human tissue; induced pluripotent stem cell; loss of function; molecular modeling; motility disorder; nerve supply; nervous system development; novel; protein B; protein protein interaction; reconstruction; respiratory; segregation; stem cell based approach; tissue reconstruction; transcription factor; transcriptome sequencing; vertebrate embryos

Summary: Modeling EA/TEF In Human PSC-­Derived Embryonic Tissues      During  development  of  the  vertebrate  embryo,  a  common  foregut  tube  gives  rise  to  the  esophagus  and  respiratory  tract  and  this  involves  an  array  of  complex  molecular  and  morphological  processes.  The  dorsal  foregut tube forms the esophagus and the ventral domain forms the respiratory tract, and failure to do so can  result in tracheaesophageal birth defects such as esophageal atresia and tracheoesophageal fistula (EA/TEF).  As  discussed  in  project  2,  much  is  known  about  how  Wnt  and  BMP  signaling  promote  a  respiratory  fate  by  activation  of  the  transcription  factor  Nkx2.1.  In  contrast,  little  is  known  about  pro-­esophageal  factors.  Mouse  and  human  studies  demonstrate  that  the  HMG-­box  transcription  factor  Sox2  is  involved  in  segregation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages,  however  whether  Sox2  promotes  an  esophageal  fate  or  acts  predominantly to repress respiratory-­inducing pathways the dorsal foregut is unclear. We hypothesize that both  mechanisms are involved in normal esophageal development.    In  humans,  most  genes  that  cause  EA/TEF  remain  unidentified.  However,  heterozygous  mutations  in  SOX2  can  cause  of  EA  and  TEF,  which  is  in  contrast  to  mice  with  heterozygous  loss  of  Sox2,  which  are  normal.  Complete loss of Sox2 from the foregut endoderm of mouse embryos results in esophageal agenesis, however  Sox2 is also expressed during development of the enteric nervous system (ENS) of the esophagus. Given that  patients  with  EA  can  have  motility  defects,  we  hypothesize  some  EA-­associated  genes  may  affect  ENS  development. However, a study of how EA-­associated mutations differentially affect the epithelium and/or ENS  of  the  esophagus  has  never  been  done  in  any  species,  let  alone  humans.  We  propose  several  novel  PSC-­ based approaches to study how Sox2 and other EA-­associated genes impact Human esophagus specification,  epithelial  morphogenesis,  and  functional  innervation  using  human  pluripotent  stem  cell-­derived  esophageal  organoids with an enteric nervous system.      In  this  project  we  aim  to  identify  the  mechanisms  underlying  esophageal  specification  and  development in humans by first focusing on the key esophageal factor Sox2. We hypothesize that SOX2  acts  both  to  repress  the  respiratory  lineage,  and  promote  an  esophageal  fate  via  an  unidentified  gene  regulatory network. We will use a human PSC-­derived foregut model in combination with SOX2 gain-­ and loss-­ of-­function  to  identify  a  respiratory  GRN  that  is  repressed  by  SOX2  and  an  esophageal  GRN  that  is  SOX2-­ dependant. Conversely we will determine if NKX2.1 represses the esophageal fate. We will take advantage of  the expandable nature of human foregut cultures to identify direct transcriptional targets of human SOX2 and  NKX2.1 using RNA-­seq and ChIP-­seq. We will then investigate the disease mechanisms underlying TEF  and EA that are caused by Sox2 mutations. We will generate PSC lines harboring patient-­based mutations in  SOX2  and  investigate  how  these  impact  the  formation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages.  We  will  identify  the  impact  of  SOX2  mutations  on  Wnt  and  BMP  signaling  and  if  Sox2  acts  by  direct  protein-­protein  interactions  with  the  effector  proteins  b-­catenin/TCF  and  Smads.  Lastly  we  will  investigate  how  EA  mutations differentially effect the different cell types of the esophagus;; the epithelial, smooth muscle  and  ENS.  Given  that  some  patients  with  EA  have  associated  motility  disorders  including  achalasia  3,  constrictions 4 and megaesophagus 5, we will investigate if Sox2 mutations also have ENS deficits. We will use  iPSC  lines  derived  from  EA/TEF  patients  identified  in  projects  1  and  2  to  model  the  molecular  deficits  underlying this birth defect using our human PSC-­derived organoid model.

摘要：在人类PSC衍生的胚胎组织中对EA/TEF进行建模     在脊椎动物胚胎的发育过程中，一个常见的面管产生了食道和 呼吸道，这涉及一系列复杂的分子和形态学过程。背 前肢管形成食道，腹侧域形成呼吸道，不这样做可以 导致气管食管生日缺陷，例如食管闭锁和气管食管瘘（EA/TEF）。 正如项目2中所述，关于Wnt和BMP信号如何促进呼吸命运的知之甚少 转录因子NKX2.1的激活。相比之下，关于亲管道因素知之甚少。老鼠 人类研究表明，HMG-box转录因子SOX2参与了隔离 食管和呼吸系统谱系，但是SOX2是促进食管命运还是作用 主要是抑制呼吸诱导途径的背侧尚不清楚。我们假设这两个 机制参与了正常的食管发育。   在人类中，大多数引起EA/TEF的基因仍然不明。但是，SOX2中的杂合突变 可能导致EA和TEF的原因，这与正常的Sox2杂合损失的小鼠相反。 小鼠胚胎的前肢内胚层完全丧失SOX2导致食管产生，但是 Sox2在食管的肠神经系统（ENS）的发展过程中也表达。鉴于 EA患者可能有运动性缺陷，我们假设某些EA相关基因可能会影响ENS 发展。但是，对与EA相关突变的研究对上皮和/或ENS的研究如何不同 在任何物种中从未做过食道，更不用说人类了。我们提出了几个新颖的PSC- 基于研究Sox2和其他EA相关基因如何影响人类食管规范的方法， 上皮形态发生和使用人多能干细胞衍生的食管的功能神经支配 带有肠神经系统的器官。   在这个项目中，我们旨在确定食道规范的基础机制和 首先关注关键食道因子SOX2，在人类中的发展。我们假设Sox2 作用既反映呼吸系统谱系，又通过未识别的基因促进食管命运 监管网络。我们将使用人类PSC衍生的前表模型与SOX2增益和损失 - 功能可确定由Sox2和Sox2-的食管GRN再现的呼吸道GRN 依赖。相反，我们将确定NKX2.1是否反映了食管命运。我们将利用 人类联邦文化的可扩展性，以确定人类Sox2和 NKX2.1使用RNA-SEQ和CHIP-SEQ。然后，我们将研究TEF的疾病机制 和由Sox2突变引起的EA。我们将生成具有基于患者突变的PSC线 Sox2并研究这些如何影响食管和呼吸系统谱系的形成。我们将 确定SOX2突变对Wnt和BMP信号的影响，以及SOX2是否通过直接蛋白质蛋白质起作用 与效应蛋白B-catenin/tcf和Smads的相互作用。最后我们将调查如何 突变对食道的不同细胞类型的影响不同；上皮平滑肌 和ens。鉴于某些EA患者患有相关运动障碍，包括Achalasia 3， 收缩4和巨型甲状腺肿5，我们将研究Sox2突变是否也具有ENS缺陷。我们将使用 从项目1和2中确定的EA/TEF患者得出的IPSC线，以建模分子缺陷 使用我们的人类PSC衍生的类器官模型来解决这个生日缺陷。