天然資源からの中性脂質代謝を制御する低分子化合物の作用機序解析

自然资源中控制中性脂质代谢的低分子量化合物的机制分析

基本信息

批准号：
15J12265
负责人：
小林啓介
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J12265/
关键词：
天然物化学脂質代謝オートファジー

项目摘要

真菌由来化合物ダイナピノンA (DPA) は、中性脂質であるトリアシルグリセロール (TG) およびコレステリルエステル (CE) の細胞内蓄積を阻害する。また、その機序は生合成経路の阻害ではなく分解経路の促進による可能性が示唆されている。そこで、脂肪滴分解経路の1つであるオートファジーへの影響を調べた。DPAの処理により、オートファジーマーカータンパク質であるLC3-II量の濃度依存的な増加が認められた。また、オートファジーの選択的な分解基質であるp62タンパク質の細胞内蓄積量がDPAの処理により濃度依存的に減少したことから、DPAはオートファジーを促進していることが示唆された。さらに、一般的に知られているオートファジー経路上の因子であるmTORやbeclin-1に対するDPA処理による影響を調べたが、これらに対する影響は確認されなかった。この結果から、DPAの作用点はこれら因子より下流、もしくは未知の経路を介している可能性が示唆された。さらに、蛍光緑色タンパク質 (GFP) が融合したLC3を発現する細胞の構築を行った。プラスミドを細胞にトランスフェクトし、シングルセルクローニングを行うことで、GFP-LC3安定発現細胞を取得した。現在は脂肪滴マーカーやリソソームマーカーとGFPの細胞内局在の解析を行っている。さらにケミカルバイオロジー的アプローチとして、ビオチン化誘導体をはじめとしたDPAのケミカルプローブを合成した。これら誘導体と細胞ライセートを反応させ、DPAの結合タンパク質を取得した。今後、各タンパク質の機能解析を通して、DPAが示す表現系との関連をさらに精査する。DPAについては、国内・国外学会で発表を行い、現在論文投稿の準備中である。その他、真菌由来であるボーベリオライドIIIの作用機序についても研究を行い、学会発表だけでなく、論文発表に至った。

真菌化合物 dynapinone A (DPA) 抑制中性脂质三酰甘油 (TG) 和胆固醇酯 (CE) 的细胞内积累。此外，有人提出该机制不是抑制生物合成途径而是促进降解途径。因此，我们研究了对自噬（脂滴降解途径之一）的影响。用 DPA 处理后，观察到 LC3-II（一种自噬标记蛋白）的量呈浓度依赖性增加。此外，p62 蛋白（自噬的选择性降解底物）的细胞内积累在 DPA 处理后以浓度依赖性方式减少，表明 DPA 促进自噬。此外，我们研究了 DPA 治疗对 mTOR 和 beclin-1（自噬途径中众所周知的因子）的影响，但尚未证实对这些因素的影响。这些结果表明 DPA 的作用点可能位于这些因素的下游或通过未知途径。此外，我们构建了表达与荧光绿色蛋白（GFP）融合的LC3的细胞。将该质粒转染细胞并进行单细胞克隆，获得稳定表达GFP-LC3的细胞。目前，我们正在分析脂滴标记、溶酶体标记和 GFP 的细胞内定位。此外，作为一种化学生物学方法，我们合成了 DPA 的化学探针，包括生物素化衍生物。这些衍生物与细胞裂解物反应以获得 DPA 结合蛋白。未来，我们将通过对各蛋白的功能分析，进一步探讨DPA与表达系统的关系。关于DPA，我们已经在国内和国际会议上发表过，目前正在准备提交论文。此外，我们还对源自真菌的 Beauveliolide III 的作用机制进行了研究，不仅发表了学术会议，还发表了论文。