Establishment of a novel therapeutic strategy against influenza virus infection based on the regulation of cellular lipid metabolism.

建立基于细胞脂质代谢调节的流感病毒感染新治疗策略。

基本信息

批准号：
21H02629
负责人：
西川喜代孝
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Doshisha University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

１）DPPSの産生が抗ウイルス性amphisomeの形成に必須であることの証明１－１）ABCA3高発現MDCK細胞ならびにPVF-tet処理した細胞を用い、IAV感染に対して産生誘導されるamphisomeを高純度に単離する系の確立を試みた。単離にあたっては、蛍光標識HAを発現するMDCK細胞を用い、PVF-tet処理後IAV感染させ、細胞をシリンジを用いてマイルドに破砕後、遠心処理によりamphisomeの粗画分を得た。この画分を抗LC3抗体で蛍光標識した。得られたamphisome画分をHAの蛍光並びにLC3の蛍光を指標に、FACSを用いてダブルポジティブ画分を分離後最終amphisomeとした。しかしながら、本法では蛍光を持たない脂質画分の持ち込みが多いことから、今後さらに純度を高める必要があることが示された。一方で、両細胞由来total lysateを用いて脂質抽出後、MS-MS分析装置を用いて各種脂質分子種分析を行った。その結果、感染に伴ってDPPS、DPPCの増加が再現性良く検出できる系を新たに確立した。１－２）siRNAを用いたPS合成酵素（PSS1）のノックダウン、PSS1の高発現細胞の樹立（MDCK細胞あるいはヒト肺胞上皮細胞株A549を使用）を試みた。これまでに、PSS1のノックダウンの系を確立し、IAV感染に伴うamphisome形成ならびに細胞障害活性・ウイルス産生量に対する効果を検討した。その結果、PSS1のノックダウンによりamphisome の形成並びにPVF-tetの抗ウイルス活性が減弱すること、を見出した。

1) 证明DPPS的产生对于抗病毒两性小体的形成至关重要 1-1) 使用高表达ABCA3的MDCK细胞和用PVF-tet处理的细胞，我们证明了由IAV感染诱导的两性小体的产生增强。旨在建立高纯度分离系统。为了分离，用 PVF-tet 处理表达荧光标记 HA 的 MDCK 细胞，然后用 IAV 感染细胞。使用注射器轻轻破碎细胞后，通过离心获得粗制的两性体级分。该级分用抗 LC3 抗体进行荧光标记。使用FACS，使用HA荧光和LC3荧光作为指示剂，将获得的两性体级分分离成双阳性级分，并用作最终的两性体。但该方法中引入了大量非荧光脂质组分，表明今后有必要进一步提高纯度。另一方面，使用来自两种细胞的总裂解液提取脂质后，使用MS-MS分析仪分析各种脂质分子种类。因此，我们建立了一个新系统，可以重复检测与感染相关的 DPPS 和 DPPC 的增加。 1-2）我们尝试使用siRNA敲低PS合酶（PSS1）并建立高表达PSS1的细胞（使用MDCK细胞或人肺泡上皮细胞系A549）。到目前为止，我们已经建立了PSS1的敲低系统，并研究了其对IAV感染后的两性体形成、细胞毒活性和病毒产生的影响。结果，我们发现 PSS1 的敲低减弱了两性体的形成和 PVF-tet 的抗病毒活性。