ゲノムマイニングに基づく異宿主発現による新規ラッソペプチドの生産

基于基因组挖掘的异质宿主表达生产新型套索肽

基本信息

批准号：
17F17095
负责人：
小谷真也
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Shizuoka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-11-10 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17F17095/
关键词：
ラッソペプチド異宿主生産ゲノムマイニング

项目摘要

ラッソペプチドとは、その構造的特徴から命名された抗菌ペプチドのグループの名称で、ラッソペプチドは主にαプロテオバクテリア、大腸菌および放線菌から発見されてきた。構造の特徴は、20-30残基のアミノ酸からなるペプチドにおいてN末端のアミノ基が、N末から9-10残基目に存在するアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖のカルボキシル基とペプチド結合を形成し、“輪”を形成する。さらにC末端の直鎖部分が輪の中を貫通するという特異な立体構造を有しており、その構造が“投げ輪”に似ているためラッソペプチドと呼ばれている。その生合成は非常にシンプルでありゲノム情報から生合成遺伝子の予測が容易である。そこで、バクテリアのゲノム情報から、生合成遺伝子クラスターの検索を行った。昨年度見出した菌株に加えて、プロテオバクテリアSphingomonas koreensis NBRC16723株のゲノム情報に、新規ラッソペプチドの生合成遺伝子クラスターを見出した。そこで、生合成遺伝子クラスターの全長をPCR法を用いて増幅した。増幅した断片は、制限酵素で消化し、以前に開発した発現用シャトルベクターpHSG396Spに組み込んだ。大腸菌を用いてクローニングを行った。単離したプラスミドをエレクトロポレーションを行い、生産菌のSphingomonas subterranea NBRC 16086株に遺伝子導入することに成功した。異宿主生産を行うための培養実験をおこない、新規ラッソペプチド生産することに成功した。その化学構造に関して、ESI-MSおよびNMRを用いた構造解析を行い、三次元立体化学を含む構造の解析に成功した。現在、抗菌活性試験を行っている段階である。

套索肽是一类根据其结构特征命名的抗菌肽，主要从α变形菌、大肠杆菌和放线菌中发现。其结构特点是，在由20-30个氨基酸残基组成的肽中，N端的氨基与天冬氨酸或谷氨酸侧链的羧基形成肽键，该羧基存在于残基9处-10从N端开始并形成“环”。此外，它具有独特的三维结构，其中C末端线性部分穿过环，并且由于其结构类似于“投掷环”，因此被称为套索肽。其生物合成非常简单，可以很容易地从基因组信息中预测生物合成基因。因此，我们从细菌基因组信息中寻找生物合成基因簇。除了去年发现的菌株外，我们在朝鲜鞘氨醇变形杆菌菌株NBRC16723的基因组信息中发现了一个新的套索肽生物合成基因簇。因此，我们使用 PCR 扩增了生物合成基因簇的全长。扩增片段用限制性内切酶消化并整合到先前开发的表达穿梭载体pHSG396Sp中。使用大肠杆菌进行克隆。将分离的质粒进行电穿孔，将基因成功导入生产菌Sphingomonas subterranea NBRC 16086菌株中。我们针对不同的宿主生产进行了培养实验，并成功生产了一种新的套索肽。我们使用ESI-MS和NMR对其化学结构进行了结构分析，并成功分析了包括三维立体化学在内的结构。目前，正在进行抗菌活性测试。