高エネルギーリン酸結合の加水分解酵素反応における遷移状態安定化メカニズム

高能磷酸键水解酶反应中的过渡态稳定机制

基本信息

批准号：
13J05019
负责人：
古池美彦
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Osaka City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ヌクレオチド代謝系の末端で精製されるADPリボース(ADPRase)はADPリボース加水分解酵素(ADPRase)によって無害化される。ADPRaseは補因子である二価金属イオンを利用しながら競争的な酸塩基触媒を実現しており、その反応機構を明らかにしようという目的でこれまでに30個程度の結晶構造がすでに報告されている。しかしながらADPRaseの活性部位に保存されている複数のGlu残基のプロトン化状態および酸解離特性についてはこれまで全く知られてこなかった。本研究課題でデザインされたADPRase結晶相pH滴定実験において、これら重要なGlu残基側鎖のサブÅスケールでの微細な構造変化を確認することができた。基質が結合していないアポ状態においてはGlu82のpKaは4.3付近、酵素基質二元複合体においてはGlu85のpKaは4.6付近にあることが分かった。これによってADPRase活性のpH依存性が原子構造の立場からも説明され、新たなADPRase反応機構を提唱するに至った。この結晶相pH滴定実験はタンパク質結晶構造解析の新たな可能性を見出したと共に、酵素学的にも興味深い結果を与えてくれることが分かった。提唱した反応機構を実証するため、より水素原子やプロトンを可視化できる中性子結晶構造解析に向けての準備も進めた。これまでよりも100倍程度大きな体積をもつADPRase結晶を調製することに成功し、重水置換操作による結晶への影響も評価済みである。パルス中性子源の定常的な運転に合わせて、中性子結晶構造解析をすぐに始めることができる段階にまで至った。当初から想定していた実施計画の大半の部分を実際に遂行することができたと考えている。

ADP核糖在核苷酸代谢系统末端纯化，通过ADP核糖水解酶无害。 Adprase通过使用Diphoton（是一个成分）实现了基于竞争酸的催化剂，并且已经报告了约30个晶体结构，以阐明存在反应机制。然而，到目前为止，尚不知道存储在Adprase活性位点中的多个GLU残基的质子化状态和酸溶液特性。在本研究问题中设计的Adprase晶体相pH -Hypedotetting实验中，我们能够确认这些重要的GLU残基侧链的细微结构变化。发现在底物没有结合的任命状态下，GLU82的PKA约为4.3，而GLU85 PKA在酶底物二进制络合物中约为4.6。结果，还从原子结构的角度解释了adprase活性的pH依赖性，并提出了一种新的adprase反应机制。这个晶体相-HIDDER测试实验发现了蛋白质晶体结构分析的新可能性，并且发现给出了酶促和有趣的结果。为了证明提出的反应机制，我们已经准备好可视化氢原子和质子的中子。已成功制备了大约100倍的adprase晶体，并且已经评估了由于重水替代操作而对晶体产生的影响。它到达了可以立即根据脉冲中性源的恒定操作开始中子晶体结构分析的阶段。我相信，从一开始就假设的大多数实施计划都可以实际执行。