組換えホットスポット活性化因子Ｐｒｄｍ９の機能解析と抑制因子の探索

重组热点激活子Prdm9的功能分析及抑制子的寻找

基本信息

批准号：
13J08945
负责人：
河野宏光
金额：
$ 2.05万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年は研究の最終年度として、「Prdm9 Knock In (KI) マウス作成による機能解析」と「相同組換え頻度検出マウス作成による抑制因子の探索」の2点について結論を出すことを目標とした。まずPrdm9 KIマウスについては繁殖率が悪く、個体数を増加させることに専念した。その後、低繁殖率と精巣の減数分裂進行の関連性を明らかにするため、免疫染色による精巣由来の精原細胞と減数分裂中の精母細胞の観察を行った。結果、KI マウスでは染色体の対合が不完全となり、減数分裂に異常が生じていた。この原因としてPrdm9タンパク質のC-末端に付加したタグ配列が、Zinc Finger Array (ZFA) 領域と干渉している可能性が考えられた。また変異lox配列を利用したKIマウス受精卵に対するインジェクションによるZFAの入れ換えも試みたが失敗した。加えて、ヒト化Prdm9によるマウス生殖能の回復実験は競合するグループに先行されたため中止した。次に相同組換え頻度検出マウスの解析を行った。当初、プロモーターと、レポーターとなるEYFPをコードしている領域は分割されていると考えられたが、プロモーター配列がレポーター領域に部分的に残存していることが判明した。そこで精子蛍光による相同組換えの検出は困難と判断し、ゲノムDNAを用いたPCRによる検出を試みた。検出系統の精巣由来ゲノムDNAを用いたところ、大半の系統では相同組換えが検出されたのに対し、一部の系統では検出されなかった。この結果は同一の組換えホットスポット配列であっても、ゲノム上の位置次第でPrdm9以外の因子により組換え頻度が変化することを示しており、組換え抑制因子の存在を支持するものであると考えられる。今後は相同組換え検出マウスによる組換え頻度の測定法に改良を施し論文を作成する予定である。

今年是该研究的最后一年，旨在得出两点结论：“通过创建 Prdm9 敲入 (KI) 小鼠进行功能分析”和“通过创建小鼠来检测同源重组频率来搜索抑制子。”首先，Prdm9 KI小鼠的繁殖率很差，所以我们集中精力增加它们的数量。随后，为了阐明低繁殖率与睾丸减数分裂进展之间的关系，我们使用免疫染色观察了睾丸来源的精原细胞和减数分裂精母细胞。结果，KI 小鼠的染色体配对不完整，导致减数分裂异常。其原因被认为是添加到 Prdm9 蛋白 C 末端的标签序列干扰了锌指阵列 (ZFA) 区域。我们还尝试使用突变的lox序列注射到KI小鼠受精卵中来取代ZFA，但这次尝试失败了。此外，一项使用人源化 Prdm9 恢复小鼠生育能力的实验因竞争组接管而终止。接下来，我们分析了检测同源重组频率的小鼠。最初，人们认为启动子和编码报告基因EYFP的区域是分开的，但发现启动子序列部分保留在报告基因区域中。因此，我们确定使用精子荧光检测同源重组是困难的，因此我们尝试使用基因组DNA通过PCR进行检测。当使用检测到的菌株的睾丸来源的基因组DNA时，在大多数菌株中检测到同源重组，但在某些菌株中未检测到。该结果表明，即使对于相同的重组热点序列，由于Prdm9以外的因素，重组频率也会根据基因组上的位置而变化，这支持了重组抑制子的存在。未来，我们计划改进利用检测同源重组的小鼠测量重组频率的方法，并就此撰写论文。