組換えホットスポット活性化因子Ｐｒｄｍ９の機能解析と抑制因子の探索

重组热点激活子Prdm9的功能分析及抑制子的寻找

基本信息

批准号：
13J08945
负责人：
河野宏光
金额：
$ 2.05万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年は研究の最終年度として、「Prdm9 Knock In (KI) マウス作成による機能解析」と「相同組換え頻度検出マウス作成による抑制因子の探索」の2点について結論を出すことを目標とした。まずPrdm9 KIマウスについては繁殖率が悪く、個体数を増加させることに専念した。その後、低繁殖率と精巣の減数分裂進行の関連性を明らかにするため、免疫染色による精巣由来の精原細胞と減数分裂中の精母細胞の観察を行った。結果、KI マウスでは染色体の対合が不完全となり、減数分裂に異常が生じていた。この原因としてPrdm9タンパク質のC-末端に付加したタグ配列が、Zinc Finger Array (ZFA) 領域と干渉している可能性が考えられた。また変異lox配列を利用したKIマウス受精卵に対するインジェクションによるZFAの入れ換えも試みたが失敗した。加えて、ヒト化Prdm9によるマウス生殖能の回復実験は競合するグループに先行されたため中止した。次に相同組換え頻度検出マウスの解析を行った。当初、プロモーターと、レポーターとなるEYFPをコードしている領域は分割されていると考えられたが、プロモーター配列がレポーター領域に部分的に残存していることが判明した。そこで精子蛍光による相同組換えの検出は困難と判断し、ゲノムDNAを用いたPCRによる検出を試みた。検出系統の精巣由来ゲノムDNAを用いたところ、大半の系統では相同組換えが検出されたのに対し、一部の系統では検出されなかった。この結果は同一の組換えホットスポット配列であっても、ゲノム上の位置次第でPrdm9以外の因子により組換え頻度が変化することを示しており、組換え抑制因子の存在を支持するものであると考えられる。今後は相同組換え検出マウスによる組換え頻度の測定法に改良を施し論文を作成する予定である。

今年是研究的最后一年，目的是在两点上得出结论：“通过在（ki）小鼠中创建PRDM9敲门来进行功能分析”和“通过创建同源重组频率检测小鼠来搜索抑制剂”。首先，PRDM9 ki小鼠的繁殖率很差，因此他们专注于增加人口。随后，为了阐明睾丸的繁殖率和减数分裂进程之间的关联，我们观察到了睾丸来源的精子症和通过免疫染色的减数分裂精子细胞。结果，染色体配对在KI小鼠中是不完整的，导致减数分裂异常。这可能是导致这是附着在PRDM9蛋白C端的TAG序列的原因，后者会干扰锌指阵列（ZFA）区域。我们还试图使用突变的LOX序列将ZFA注入受精的Ki小鼠卵中，但失败了。此外，在竞争组之前，恢复了用人源化PRDM9恢复小鼠生育能力的实验。接下来，分析了小鼠的同源重组频率检测。最初，启动子和编码报告基因EYFP的区域被认为是分裂的，但发现启动子序列部分保留在记者区域。因此，确定使用精子荧光很难检测出同源重组，并尝试使用基因组DNA通过PCR检测它。使用检测线中睾丸来源的基因组DNA，在大多数线中都检测到同源重组，而未检测到一些线。该结果表明，即使使用相同的重组热点序列，重组频率也会根据PRDM9以外的因素而变化，这取决于基因组中的位置，并且被认为支持重组抑制剂的存在。将来，我们计划使用同源重组检测小鼠来改善重组频率的方法并准备纸。